王镜岩(第三版)生物化学下册课后习题答案

第34章 DNA的复制和修复

⒈生物的遗传信息如何由亲代传给子代？

答：在细胞分裂间期，DNA分子边 解旋边复制，分别以亲代DNA的两条母链为模板，以核中游离的脱氧核苷酸为原料，根据碱 基互补配对原则，合成两条子链，它们分别与相应的模板链螺旋化就形成了两个与亲代DNA 一样的子代DNA，在生物传种接代的过程中，亲代将复制出的一份DNA通过配子传给子代，从 而实现了亲子代间遗传信息的传递。接下来，在子代个体发育的过程中，将利用DNA(gene)来指导自身蛋白质的合成，从而表现出与 亲代相似的性状。

也有一些生物如某些病毒，是通过将亲代的RNA复制后传给子代的方式进行遗传信息的传递。

⒉何谓DNA的半保留复制？是否所有的DNA复制都以半保留的方式进行？（双链DNA通常都以半保留方式复制。）

答：DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制(semiconservative replication)。

并非所有的DNA复制都以半保留的方式进行，但双链DNA通常都以半保留方式复制。

⒊若使15N标记的大肠杆菌在14N培养基中生长三代，提取DNA，并用平衡沉降法测定DNA密度，其14N-DNA分子与14N-15N杂合DNA分子之比应为多少？ 答：这两者之比为1:3。

⒋比较DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ性质的异同。DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ的功能是什么？有何生物学意义？

答：在E.coli中，共发现了3种DNA聚合酶，即DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

DNA聚合酶Ⅰ是个多功能酶，具有5’--→ 3’聚合功能；3’--→ 5’外切功能以及3’--→ 5’外切功能。DNA聚合酶Ⅱ与DNA聚合酶Ⅰ功能相似，但没有5’--→ 3’外切功能。 DNA聚合酶Ⅲ与DNA聚合酶Ⅱ功能相同，但其聚合活性比DNA聚合酶Ⅰ高1000倍，是E.coliDNA复制中的最主要酶。

DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在1999年才被发现的,它涉及DNA的错误倾向修复(errorprone repair)。当DNA受到较严重损伤时, 即可诱导产生这两个酶,使修复缺乏准确性(accuracy),因而出现高突变率。其生物学意义在于高突变率虽会杀死许多细胞,但至少可以克服复制障碍, 使少数突变的细胞得以存活。

⒌DNA复制的精确性、持续性和协同性是通过怎样的机制实现的？

答：DNA聚合酶Ⅲ由10个亚基组成，这些亚基将催化DNA合成、校对和夹位DNA等功能有机地组合在一起，保证了DNA复制的精确性、持续性和协同性。

⒍何谓DNA的半不连续复制？何谓冈崎片断？试述冈崎片断合成的过程？

答：DNA的双螺旋结构中的两条链是反向平行的，当复制开始解链时，亲代DNA分子中一条母链的方向为5′～3′，另一条母链的方向为3′～5′。DNA聚合酶只能催化5′～3′合成方向。在以3′～5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′～3′方向的前导链，前导链的前进方向与复制叉的行进方向一致，前导链的合成是连续进行的。而另一条母链仍

以3′～5′方向作为模板，复制合成一条5′～3′方向的随从链，因此随从链会成方向是与复制叉的行进方向相反的。随从链的合成是不连续进行的，先合成许多片段，即冈崎片段。最后各段再连接成为一条长链。由于前导链的合成连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制。

DNA复制时，在滞后链上，较短的DNA片段（大约1000-2000个核苷酸）是在分段合成引物的基础上，非连续合成的，这些不连续的DNA片段最先由日本科学家冈崎在电子显微镜下发现，故称为冈崎片断(Okazaki fragment)。

引发体在滞后链上沿5'→3'方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动)，在一定距离上反复合成RNA引物。DNA聚合酶Ⅲ从RNA引物的3，-OH 端合成冈崎片段。

⒎DNA复制时双链是如何解开的？比较类型Ⅰ和类型Ⅱ拓扑异构酶的作用特点和生理功能。 答：DNA复制起始的体外实验表明需要6种蛋白,Dna A、Dna B、Dna C、组蛋白样蛋白(HU)回旋酶及单链结合蛋白(SSB)形成起始复合物。Dna A单体首先结合到复制起始点上4个含9 bp的重复顺序上。然后20～40个Dna A单体结合到复制起始点形成一个核心。在Dna A蛋白的作用下位于复制起始点右侧的3个含13 bp的重复顺序开始解链形成开放复合体。Dna B/Dna C在复制起始区充当了起始的引发体（primosome）。Dna B?Dna C复合体转变为Dna B六聚物，形成复制叉。Dna B提供解旋酶（helicase）活性，使DNA解旋，可能它识别复制叉上潜在的单链结构，从13 bp的重复顺序上取代出Dna A，并开始解螺旋。Dna B在复制起始区域以很少的量（1－2六聚物）担负着催化作用。在那儿Dna B还具有激活Dna G引发酶的能力。解旋反应还需要另外两种蛋白，旋转酶（Gyrase）和SSB（单链结合蛋白）。旋转酶也就是Top Ⅱ，其作用是解旋，即让一条链绕着另一条链旋转。若没有这步反应，解开双链就会产生DNA的扭曲。SSB可使已形成的单链处于稳定状态。 拓扑异构酶Ⅰ（Topo Ⅰ），将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松弛超螺旋的方向转动，然后再将切口封起。拓扑酶I松弛超螺旋不需ATP参与。 拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ），它的作用特点是切开环状双链DNA的两条链，分子中的断端经切口穿过而旋转，然后封闭切口。Topo Ⅱ在ATP参与下，将DNA分子从松弛状态转变为负超螺旋，为DNA分子解链后进行复制及转录作好准备。

⒏天然双链闭环DNA(cccDNA)的比超螺旋(δ)为-0.05，复制时解螺旋酶将双链撑开，如果反应系统中无旋转酶，当比超螺旋达到+0.05时，DNA的扭曲张力将阻止双链解开，此时已解开的双链占DNA分子的百分数是多少？

答：此时已解开的双链占DNA分子的百分数是9.52%。

⒐何谓复制体？试述其主要成分的功能。

答：与DNA复制有关的酶和蛋白质因子由30多种，他们在复制叉上形成离散的复合物，彼此配合，进行高度精确的复制，这种结构称为复制体。

复制体的主要成分有,Dna A、Dna B、Dna C、组蛋白样蛋白(HU)回旋酶、单链结合蛋白(SSB)、引物合成酶、RNA聚合酶、DNA旋转酶，Dam甲基化酶以及DNA聚合酶等。复制体在DNA复制叉上进行的基本活动包括： 双链的解开，RNA引物的合成，DNA链的延长，切除引物，填补缺口，连接相邻的DNA片断，切除和修复尿嘧啶和错配碱基。

⒑DNA的复制过程可分为哪几个阶段？其主要特点是什么？复制的起始是怎样控制的？ 答：DNA的复制过程包括复制的起始、延伸和终止三个阶段。

（1）复制的起始

引发：当DNA的双螺旋解开后，合成RNA引物。

引发体沿着模板链5’→3’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。 （2）DNA链的延伸

前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNA pol.Ⅲ催化。

复制体沿着复制叉方向前进合成DNA。

DNA polⅠ的5，→ 3，外切活力，切除RNA引物。 DNApolⅠ的5，→ 3，合成活性补齐缺口。

DNA ligase，动物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。 （3）DNA合成的终止

环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。

DNA复制的调控主要是起始阶段的调控。原核生物DNA复制的调控与其生长环境有关，真核生物DNA复制的调控与细胞周期蛋白等多种蛋白质因子有关，机制十分复杂，但复制起始点必须全甲基化后复制才能发生。

⒒真核生物DNA聚合酶有哪几种?它们主要功能是什么？ 答：真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ等五种。

真核生物的DNA复制是在DNA聚合酶α与DNA聚合酶δ互配合下催化进行的，还有一些酶及蛋白质因子参与反应。DNA Polα与引发酶共同起引发作用，然后由DNA Polδ催化前导链及随从链的合成。在链的延长中，有 PCNA（增殖细胞核抗原）参与，保障连续性DNA Pol的性质与DNA Polδ有相似之处，在有些情况下，它可代替 DNA Polδ起作用，例如在DNA损伤时，催化修复合成。DNA Polγ是线粒体中DNA复制酶。

DNA Polδ及�壕�有外切酶活性，因此也有编辑功能，校正复制中的错误。它们的5′→3′外切酶活性可能在切除引物RNA中有作用。 真核生物 DNA聚合酶的主要功能见下表： 酶活性��

5′→3′聚合作用

3′→5′外切作用 α β γ δ e + - + - + + + + + +

细胞内定位功能 核 复制、引发 核 修复 线粒体 复制 核 复制 核 复制

⒓真核生物染色体DNA的端粒有何功能？它们是如何合成的？

答：真核生物线形染色体的末端具有一种特殊的结构，称为端区或端粒。端区结构中有核苷酸重复序列，一般在一条链上为TxGy，互补链为CyAx，x与y大约在1-4范围内，人的端粒区含有TTAGGG重复序列。

端区具有保护 DNA双链末端，使其免遭降解及彼此融合的功能。端区的平均长度随着细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短，可导致核生物染色体稳定性下降，并导致衰老。其分子机制在于，线形DNA分子不能从末端核苷酸外合成RNA引物，如此染色体将逐代缩短。但是在生殖细胞、胚胎细胞和肿瘤细胞中，由于有端粒酶，所以并不出现这种情况。 端粒酶是一种由 RNA和蛋白质组成的酶，RNA和蛋白质都是酶活性必不可少的组分。可看作是一种反转录酶。此酶组成中的RNA可作为模板，催化合成端区的DNA片段。端粒酶催化合成端区，在保证染色体复制的完整性上有重要意义。

⒔哪些因素能引起DNA损伤？生物机体是如何修复的？这些机制对生物机体有何意义？ 答：一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。

紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT），两个T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC间也可形成少量二聚体（CT、CC），使复制、转录受阻。 细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去DNA上的损伤，恢复DNA的双螺旋结构。目前已知有4种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复、SOS反应诱导的修复，后三种不需要光，又称为暗修复。 1.直接修复

1949年已发现光复活现象，可见光（最有效400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。 2.切除修复

在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。 3.结构缺陷的修复：

（1）核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。 （2）核酸外切酶切除损伤的DNA。 （3）DNA聚合酶修复。 （4）DNA连接酶连接。

4.无嘌呤无嘧啶——碱基缺陷或错配——脱碱基（N-糖苷酶）：

甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β-糖苷键，造成脱嘌呤作用；酸也能使DNA脱嘌呤。

DNA复制时，DNA聚合酶对dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP掺入DNA链。细胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌呤-N-糖苷酶切掉次黄嘌呤。对于无嘌呤无嘧啶的损伤有两种修复方法：

（1）AP核酸内切酶切开，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修复，DNA连接酶连接。 （2）插入酶插入正确碱基。 5.重组修复

切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。

在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。

重组修复至少需要4种酶组分。重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。recB、recC

基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。 6.易错修复和应急反应（SOS反应）

诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。

SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（无差错修复）和易错的修复。

避免差错的修复：SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。

易错的修复：SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于易错的修复。 SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不仅在同源重组中起重要作用，而且它也是SOS反应的最初发动因子。在有单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活而表现出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌体的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd）许多基因的阻遏物，当它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基因uvrA、uvrB、uvrC（分别编码核酸内切酶的亚基）以及recA和lexA基因本身，还有单链结合蛋白基因ssb，与λ噬菌体DNA整合有关的基因himA、与诱变作用有关的基因umuDC，与细胞分裂有关的基因sulA，ruv，和lon，以及一些功能不清楚的基因dinA，B，D，F等。

DNA的修复机制对保证遗传信息在传递过程中的忠实性，连续性具有重要的意义。

⒕何谓应急反应(SOS)和易错修复？它们之间是什么关系？SOS反应对生物机体有何意义？ 答：诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。

SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（无差错修复）和易错的修复。

避免差错的修复：SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。

易错的修复：SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于易错的修复。 易错修复是应急反应(SOS)中的一种。

SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，它为生物在极为不利的环境中求得生存提供了机会。

⒖何谓突变？突变与细胞癌变有何联系？

答：基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，亦称点突变。在自然条件下发生的突变叫自发突变，由人工利用物理因素或化学药剂诱发的突变叫诱发突变。基因突变是生物变异的主要原因，是生物进化的主要因素。在生产上人工诱变是产生生物新品种的重要方法。

根据基因结构的改变方式，基因突变可分为碱基置换突变和移码突变两种类型。 基因突变有可能破坏DNA复制和细胞分裂的正常调控机制，引起细胞癌变。

⒗DNA复制时两条链发生错配的概率是否相等？两条链错配修复的概率是否相等？ 答：DNA复制时两条链发生错配的概率不相等。两条链错配修复的概率也不相等。

⒘为什么引起SOS反应的化合物通常都是致癌剂？

答：由于癌变有可能是通过SOS反应诱变造成的，因此能引起SOS反应的化合物通常都具

有致癌作用。

⒙试述Ames试验的原理。

答：B．N．Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验，亦称Ames试验。该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。Ames试验的原理是：

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。

鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。 第35章 DNA的重组

⒈DNA重组有何生物学意义？是否可以说没有DNA重组就没有生物进化？ 答：DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组。

DNA重组能迅速增加群体的遗传多样性，使有利突变与不利突变分开，通过优化组合积累有意义的信息。DNA重组参与许多重要的生物化学过程，为DNA损伤或自制障碍提供修复机制。某些基因的表达受DNA重组的调节。基因发育过程也受到基因加工的控制。另外，DNA重组对生物进化起着关键性作用。 可以说没有DNA重组就没有生物进化。

⒉是分析DNA复制 、修复和重组三者之间的关系。

答：DNA复制是DNA修复和重组的基础，修复保证了DNA复制的准确性，重组是修复的方式之一。

⒊DNA重组可分为哪几种类型？它们的主要特点是什么？

答：DNA重组有3种类型，分别是同源重组、特异位点重组和转座重组。

同源重组发生是依赖大范围的DNA同源序列的联会。重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。其特点是：需要重组的蛋白质参与；蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高；真核生物染色质的状态影响重组的频率。

特异位点重组的特点：重组依赖于小范围同源序列的联会，发生精确的断裂、连接，DNA分子并不对等交换。

转座重组的特点：完全不依赖于序列间的同源性而使一段DNA序列插入另一段中，但在形成重组分子时往往是依赖于DNA复制而完成重组过程。

⒋什么是同源重组？它有何功能？

答：同源重组又叫一般性重组，它是由两条同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片段交换的过程。

同源重组的功能是在减数分裂中使四联体某些位置的非姊妹染色单体之间可以发生交换。

⒌简要说明Holliday模型。

答：一对同源染色体有4个染色单体，每一染色单体是一条DNA双链，所以一对同源染色体有4条DNA双链。在晚偶线期和早粗线期染色体配对时，同源非姊妹染色单体的DNA

分子配合在一起；核酸内切酶识别DNA分子上的相应断裂点（breakage point），在断裂点的地方把磷酸二酯键切断，使两个非姊妹DNA分子各有一条链断裂；两断链从断裂点脱开，螺旋局部放松，单链交换准备重接；在连接酶的作用下，断裂以交替方式跟另一断裂点相互联结，形成一个交联桥（cross-bridge），这结构又称Holliday中间体（Holliday intermediate）；这交联桥不是静态的，可以靠拉链式活动沿着配对DNA分子向左右移动，其中互补碱基间形成的氢键从一条亲本链改为另一条亲本链，于是移动后在两个亲本DNA分子间留下较大片段的异源双链DNA，这种结构又称为Holliday结构；随后这交联桥的两臂环绕另外两臂旋转成为十字形，并在交联部分断开，消除交联体，恢复为两个线性DNA分子，即形成Holliday结构的异构体；断开方向或沿东西轴进行，或沿南北方向进行；如沿东西方向切断，即上连、下连，则产生的两个异源双链的两侧基因为AB和ab，仍保持亲代类型，如沿南北方向切割，即左连、右连，则两侧基因为Ab和aB，产生两个重组类型，但不论是那种情况，即Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，它们都含有一个异源双链DNA区，有关的两核苷酸区段分别来自不同的亲本，从而由原来的G-C、A-T配对变为G-A、C-T非配对。

⒍细菌基因转移有哪几种方式？它们有何生物学意义？

答：细菌的基因转移方式有转化、转导、溶原性转换、接合和原生质体融合等五种方式。 细菌可通过细胞间基因转移，并通过基因重组以适应随时改变的环境。

⒎参与同源重组主要的酶和辅助因子有哪些?简要说明其作用机制。

答：参与同源重组主要的酶和辅助因子有：Rec A蛋白、Rec BCD酶、Ruv A 蛋白、Ruv B 蛋白、Ruv C 蛋白、DNA 聚合酶和DNA连接酶。

Rec A蛋白，能促使两个同源DNA分子的碱基配对，形成杂种分子。Rec A蛋白首先与单链DNA结合（约每分子可结合５个核苷酸），形成一条DNA－蛋白质细丝（需消耗ATP）。于是Rec A蛋白即被活化而可将双螺旋解旋和分离，同时企图将它结合的单链与被解旋区域退火，如此继续下去，直到找到互补顺序。只要一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继续驱使配对反应趋于完成，其方向是５’→３’（单链部分）。当新的杂交双链形成时，Rec A蛋白即从原来的单链掉下来。

Rec BCD酶首先结合在又螺旋的游离端上，然后利用ATP供给的能量沿着双螺旋向前推进。在其行经之处，一路上解旋并又复旋。但由于解旋的速度快于复旋速度，所以解旋的双链区就越来越长。

Ruv A 蛋白识别 Holliday联结体的交叉点，Ruv A 蛋白四聚体结合其上形成四方平面的构象，使得分支点易于移动，Ruv A蛋白还帮助Ruv B 蛋白六聚体环结合在双链DNA上。Ruv B是一种解旋酶，可推动分支移动。同源重组最后由Ruv C可将Holliday联结体切开，并由DNA 聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。

⒏何谓特异位点重组？其作用特点是什么？

答：位点专一性重组 这类重组在原核生物中最为典型。它发生在特殊的序列对之间，这种重组依赖于小范围同源序列的联会。在重组对之间的短的同源序列是供重组蛋白识别用的，它对同源性的要求不象同源性重组那么重要，蛋白质和DNA、蛋白质和蛋白质之间的作用更为关键。重组时发生精确的切割、连接反应，DNA不失去，不合成。两个DNA分子并不交换对等的部分，有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，因此又将这种形式的重组称为整合式重组(integrative recombination)。例如l噬菌体DNA通过其att位点和大肠杆菌DNA的attB位点之间专一性重组而实现整合过程。在重组部分有一段15 bp的同源序列，这一同源序列是重组的必要条件，但不是充分条件，还须位点专一性的蛋白质因子参与催化。

这些蛋白质因子不能催化其他任何两条不论是同源的还是非同源序列间的重组，这就保证了l噬菌体DNA整合方式的专一性和高度保守性。这一重组不需要RecA蛋白质的参与。

⒐说明λ噬菌体DNA的整合和切除过程。

答：这是一种特异位点重组，其基本过程如下：attB由称为BOB’的序列组成，而attP由POP'组成。O是核心序列，是attB和attP所共同的。而其两侧的序列是B，B’和P，P’，被称为臂。噬菌体DNA是环状的，重组时被整合入细菌染色体中，成为线性序列。前病毒的两侧是两个新的杂种att位点，左侧称为attL，由BOP’组成，而右侧为attR，由POB’组成。可见，整合和切出并不涉及相同的一对序列：整合需要识别attP和attB，而切出要求识别attL和attR。因此，重组位点的识别就决定了位点专一性重组的方向??整合或切出。虽然位点专一重组是可逆的，但反应的方向取决于不同环境条件，这对决定噬菌体的生命力周期是非常性重要的。整合的。整合酶和IHF对整合和切出都是是必需的，而切出酶在控制反应方向上起重要作用??它对切出是必须的，但能抑制整合。在切除的环化过程中如果发生错误，前噬菌体可能失去某些基因而代之以其相邻的细菌基因。因为整合位点处于细菌染色体的gal和bio基因之间，切除过程中噬菌体DNA偶尔会带走gal基因，生成λgal（或称λdb）。λgal或λbio转导（感染）新的宿主时常常把gal或bio基因带到新的宿主中去，所以把λgal或λbio这些带有某些宿主基因的噬菌体称为转导噬菌体（transducing phage）。

⒑何谓鞭毛相转变？它如何控制鞭毛基因的表达？

答：鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种,分别为H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋 白。在单菌落的沙门氏菌中经常出现少数呈另一H抗原的细菌,这种现象称为鞭毛相转变。 沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 hix为反向重复序列,它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P,其一驱动hin基因表达,另一正向时驱动H2和rH1基因表达,反向(倒位)时H2和rH1不表达。

⒒试总结免疫球蛋白基因重组的规则。

答：免疫球蛋白由两条轻链（L链）和两条重链(H链)组成，它们分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(λ链和κ链)，一个编码重链。重链基因的V-D-J重排和轻链基因的V-J重排均发生在特异位点上。免疫球蛋白基因重组的规则如下：

a） λ链的重组：每个C片段前有J跟随；只在V和J-C之间发生一次重组(V和J的重组)。 b） κ链的重组：一条κ轻链也由两部分组装而成，但在C基因的组织过程中有所不同。一组5个J片段包含500-700个碱基对并被Cκ外显子上的一个2-3kb的内显子所隔离。在鼠中，中心J片段是无功能的（ΨJ3）。一个Vκ片段可以被连接到任何一条J片段上去。 无论用的是哪个J片段，都可以成为原始可变外显子的终端部分。整合J片段左边的每个J片段都会缺失掉。而右边的J片段都会被作为可变和不可变外显子之间的内显子的一部分。 c) 重链基因V、D和J片段的重组: 重链的可变区由V和J基因及第三个D基因片段 编码；V-D-J连接由两个阶段组成，第一个阶段是D片段和一个JH片段重组，然后是一个VH片段再和DJH片段重组。这个重构导致了邻近的CH片段（包含几个外显子）的表达。重组只发生在间隔为12 bp与间隔23 bp的不同信号序列之间，称为12-23规则。

⒓免疫球蛋白基因重组过程中产生的P核苷酸和N核苷酸是如何来的？它们产生的意义和需要付出的代价是什么？

答：免疫球蛋白基因在重组过程中，RAG1/RAG2复合物切开七核苷酸与基因接头处的一 条链，形成3，－OH、5，－P未端。游离的3，－OH攻击 另一条链的酯键，在基因片段

末端形成发夹结构。然后复合物进一步将发夹结构切开，单链切开的位置往往不是原来通过转酯反应连接的位置，多出的核苷酸与末端序列相同，但方向相反，称为P核苷酸。末端可以被外切酶切除一些核苷酸，也可以由脱氧核苷酸转移酶外加一此核苷酸，称为N核苷酸。 在接头处随机插入或删除核苷酸可以增加抗体基因的多样性，但如果插入或删除核苷酸数不是3的倍数，就将改变阅读框架而使基因失活。

⒔何谓转座重组？它有何生物学意义？

答：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座重组。转座重组的生物学意义有： 可引起基因突变——插入或切离；改变染色质的结构（缺失、倒位等）；可以插入新基（ampR、terR等）；在靶序列上引入新的转座子序列，原来序列保持不变；在靶序列上造成同向重复序列；产生新的变异，有利于进化。

⒕细菌的转座因子有几种？它们的结构有何特点？

答：微生物的某些DNA片段作为一个独立单位可在染色体上移动，此种移动甚至可发生在不同种细胞之间。这种可移动的DNA片段称之为转座因子。细菌的转座因子有两种类型：插入序列(insert sequence，IS)和转座子(transposon，Tn)。

插入序列不含任何宿主基因，是最简单的转座子，它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。所有插入序列的两端都有反向重复。

转座子除编码转座功能有关的基因外还携带抗性或其它标记基因。按结构可分为组合因子和复合因子。

⒖何谓Shspiro中间体？何谓共整合体？它们之间有何关系？

答：转座酶识别转座子的末端反向重复序列并且在其3，端切开，同时在靶部位交错切开单链，它的5,端突出末端与转座子的3，端连接，形成Shspiro中间体。

在复制转座过程中，由转座酶分别切割转座子的供体和受体DNA分子，转座子的末端与受体DNA分子连接，并将转座子复制一份拷贝，由此生成的中间体即共整合体(cointegrat，)。 共整合体可以理解为是一种特殊的Shspiro中间体。

⒗为什么真核生物转座因子可分为自主因子和非自主因子？它们转座的生物效应是否相同？

答：真核生物由于有核存在，其转录和翻译在时空是的隔开的。因此，真核生物细胞内只要存在转座酶，任何序列片段只要存在该酶识别的反向重复末端均可发生转移，而无需由转移序列自身编码这些酶。因此真核生物转座因子可分为自主因子和非自主因子。 它们转座的生物效应是不同的。自主因子能自主发生转座，而非自主因子能抑制邻近基因的表达，它本身不能转座，但在自主因子存在时，可发生转座。

⒘比较玉米的Ac-Ds系统和Smp-dSmp系统的特点。

答：在Ds-Ac系统中，大部分自主因子AC的长度由含5个外显子的单个基因组成，其产物是转座酶，它的末端有11bp的IR和8bp的DR，DR是由靶位点重复而成。

各种Ds因子的长度和序列都不相同，但和Ac相关。其末端同样有11bp的IR。Ds比Ac短，其缺失的长度不同。Ac/Ds发生的转座是通过非复制机制，并且伴随着它们从供体位置的消失。

Spm和En自主因子实际上是相同的。它们仅在不到10个位置上有差异。就像其它的转座子一样，末端含有13bp的IR，此重复序列对于转座是必须的，末端缺失就会形成转座的缺

陷型。与Spm相关的转座子在其它的植物中也有发现，它们的结构相似，属于同一个家族。它们末端IR都邻接着靶DNA重复而产生的3bp的DR。末端的IR称为转座的CACTA群。 这个家族所有的非自主因子（dSpm是缺陷的Spm）都和Spm因子本身的结构密切相关。它们是tnpA缺失了外显子。

Spm的插入能控制位点基因的表达，受体位点可能受到正的的或负的调控。一个Spm-可抑制基因座（Spm- suppressible locus）受到抑制而不能表达。一个spm- 依赖性座位（spm- dependent locus）只有在spm的帮组下才表达。当被插入的因子是一个dSpm时，对转移功能的抑制或依赖由一个自主性Spm来提供。这两个相反作用的基础是什么呢？

一个dSpm-可抑制等位基因中其外显子内插入了一个dSpm，人们对这个结构会立即产生疑问，一个基因其外显子中插入了一个dSpm它怎么能表达！这个dSpm序列能在转录本中利用这个序列的末端被剪切掉。这个剪切事件可以使mRNA序列中留下一个变化。这样，就解释了它所编码的蛋白性质发生改变的原因。同样某些插入的Ds也可从转录本中被剪切掉。 TnpA为原称为Spm因子，它提供了抑制功能。缺陷型因子的存在可能使它所插入的基因表达减少，但并不消失。然而诱导一个具有一个有功能的tnpA基因的自发因子可能会抑制靶基因的表达。抑制作用是TnpA结合于缺陷因子中的靶位点的能力产生的，从而阻断了正在进行的转录。

一个dSpm-依赖性等位基因在其附近（而不在基因中）含有一个插入序列。这个插入序列提供了一个增强子，它可以激活位于受体座位的基因的启动子。

在dSpm因子上的抑制和依赖的存在取决于一个自主因子Spm因子tnpA基因的反式作用产物与这个因子末端的顺式作用位点间的相互作用。因此在蛋白质和此因子末端之间的单个相互作用不是抑制就是激活受体基因上游或者受体基因中的靶座位。无论靶座位点否依赖这种因子。

Spm因子从完全活化到隐蔽在此范围内以各种状态存在。隐蔽因子是沉默的，既不转座也不激活dspm因子。一个潜伏的因子可以通过和完全活化的Spm因子的相互作用而转变或恢复成活性状态。失活是由于在转录起始是附近的序列被甲基化而导致的。

⒙果蝇P因子在杂种不育中起何作用？杂种不育与物种形成有何关系？

答：在和M雌果蝇杂交中P型雄果蝇的任何一条染色体都能导致不育。重组染色体的贡献表明，在每条P型雄果蝇染色体中的各区域也都导致不育。这表明P雄果蝇具有大量的P因子（P factors），这个因子存在于很多不同的染色体位置上。这些位置在P品系的个体之间也是不同的。而在M雌果蝇的染色体上都没有这种P因子。通过对杂种不育果蝇的W突变体的DNA作图发现，不育是P因子的存在所致导的。所有的突变都是由于W位点插入了DNA片段。这个插入顺序被称为P因子（P element）。

杂种不育减少了品种间的杂交，是新种形成途径的一个步骤。 如果杂种不育系统是在某些地理位置通过转座产生的。另一些因子可能是在其它某些地理位置产生的不同系统。两个不同区域的果蝇同是两个不同的系统而将产生杂种不育。若这一表现使它们之间杂种不育那么群体将出现隔离，进一步的隔离可能还会发生，多个杂种不育系统导致它们之间不能交配而形成新种。

第36章 RNA的生物合成和加工

⒈比较四类聚合酶性质和作用的异同（四类聚合酶是：DNA指导的DNA聚合酶，DNA指导的RNA聚合酶，RNA指导的RNA聚合酶，RNA指导的DNA聚合酶）

答：DNA指导的DNA聚合酶是 以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA指导的DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5'→3'（4）除聚合DNA外还有其它功能。所有原核和真核的DNA聚合酶都具有相同的合成活性，都可以在3'－OH上加核苷酸使链延伸，其速率为1000 Nt/min。加什么核苷酸是根据和模板链上的碱基互补的原则而定的。 DNA指导的RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。RNA聚合酶（RNA polymerase）的作用是转录RNA。有的DNA指导的RNA聚合酶有比较复杂的亚基结构。

RNA指导的RNA聚合酶或RNA复制酶是在某些RNA病毒中有以病毒RNA为模板催化RNA合成的酶。RNA复制酶催化的合成反应是以RNA为模板，由5′向3′方向进行RNA链的合成。RNA复制酶缺乏校对功能的内切酶活性，因此RNA复制的错误率较高，RNA复制酶只是特异地对病毒的RNA起作用，而宿主细胞的RNA一般并不进行复制。

RNA指导的DNA聚合酶是反转录酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。

⒉原核生物RNA聚合酶是如何找到启动子的？真核生物聚合酶与之相比有何异同？

答：原核生物RNA聚合酶是在δ亚基引导下识别并结合到启动子上的。不同类型的δ亚基识别不同类型的启动子。

真核生物RNA聚合酶自身不能识别和结合到启动子上，而需要在启动子上由转录因子和RNA聚合酶装配成活性转录复合物才能起始转录。

⒊何谓启动子？保守序列与共有序列的概念是否一样？Pribnow框与启动子之间是何关系？ 答：启动子是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。

保守序列与共有序列的概念的含意基本相同。保守序列间相似度高，但不一定相同，面共有序列是相同的，共有序列可理解为是一种特殊的保守序列。 Pribnow框是启动子序列的一部分。

⒋真核生物三类启动子各有何特点？

答：真核生物有三种RNA聚合酶：RNA聚合酶I、II、III，分别转录rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA。与之对应，有三种类型的启动子。

类型I：Ⅰ类启动子负责转录编码核糖体RNA的多顺反子转录本。脊椎动物RNA聚合酶I的启动子有两部分组成，包括转录起点附近的核心启动子(core promoter) ，和起点5’上游100bp左右的上游控制元件(upstream control element,UCE)。核心启动子从-45到+20，负责转录的起始。UCE从-180延伸到-107，此区可增加核心元件的转录起始的效率。

RNA Pol Ⅰ需要2种辅助因子：UBF1（上游结合因子1）是一个单链多肽，它可以和核心区UCE的G.C丰富区结合。SL1因子， SL1含有4个蛋白，其中之一称TATA框结合蛋白（TBP）。SL1本身对这种启动子来说并非是特异的，但一旦UBF1和DNA结合了，那么SL1就可以协同结合在DNA上。当这两个因子都结合上了RNA聚合酶才能和核心启动子结合起始转录。 类型II： RNA聚合酶Ⅱ的启动子

RNA聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区： （1）、 TATA框（Hogness框） 中心在-25至-30，长度7bp左右。

碱基频率：T82 A97 A85 A63 （T37 ）A83 A50（T37 ）（全为A-T，少数含有一个G-C对）。 此序列功能：使DNA双链解开，并决定转录的起点位置，失去TATA框，转录将可能在许多

位点上开始。

TATA框的改变或缺失，直接影响DNA与酶的结合程度，会使转录起始点偏移，因此，TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的。

由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构，同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离，决定了起始位点的正确选择。启动子特定序列和酶的正确结构，这两者把酶置于一种正确的构象中，决定了识别的正确性和转录起始的正确性。 （2）、 CAAT框

中心在-75处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT 功能：与RNA聚合酶结合。 （3）、 GC框

在CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。

CAAT和GC框均为上游序列，对转录的起始频率有较大影响。

类型III ：是由不同的转录因子以不同的方法来识别的。5S RNA和tRNA都属于RNA 聚合酶Ⅲ启动子，但它们比较特殊，位于起始位点的下游的转录区内，因此也称为下游启动子（downstream promoter）或基因内启动子（intragenenic promoter）或称为内部控制区（internal control region ,ICR）。snRNA基因的启动子和常见的启动子一样位于起始位点的上游，称为上游启动子（upstream type 0f promoter）。下游启动子又可分为1 型和2型。1型内部启动子含有两个分开的boxA（T G G C N N A G T G G）和boxC（C G G T C G A N N C C）序

列。而Ⅱ型内部启动子含有两个分开的boxA和boxB。2型内部启动子中boxA和boxB之间的距离较宽。通常有功能的此类启动子中的两个box就不能紧紧连在一起。在1型内部启动子中（5SRNA基因启动子）TFⅢA结合在C框上，使TFⅢC结合在C框下游。在Ⅱ型内部启动子中TF Ⅲ C的结合使TFⅢ B依次结合在起始位点的近上游。TF Ⅲ B结合在起始位点上并和TF Ⅲ C相连。RNA聚合酶Ⅲ的上游启动子有3个上游元件，这些元件仅在snRNA启动子中被发现，有的SnRNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录，有的是由RNA聚合酶Ⅲ转录。这些上游元件在一定程度上和polⅡ的启动子相似。

TATA元件看来和特异的聚合酶结合上游启动子转录起始发生在起始点上游的一个很短的区域中，且含有TATA框。次近端序列元件（proximal sequence element,PSE）和八聚体（OCT）元件的存在大大增加了转录效率，结合在这些元件上的转录因子相互协同作用。TATA元件是供TBP识别的，TBP亚基本身识别DNA序列，其结合的其他蛋白有的可和RNA聚合酶Ⅲ结合，有的对RNA聚合酶Ⅱ特异，这就可以解释为什么RNA聚合酶Ⅲ和这些启动子特异结合。TBP及其结合蛋白的功能是使RNA聚合酶Ⅲ正确地结合在起始位点上。

⒌何谓终止子和终止因子？依赖于 rho 的转录终止信号是如何传递给RNA聚合酶的？ 答：提供转录终止信号的一段 DNA 序列，叫终止子。协助 RNA 聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子，叫终止因子。

Rho结合在新生成的RNA链上，借助消解NTP所获得的能量沿RNA链移动。RNA酶遇到终止子时发生暂停，使Rho得以追上酶，并与之相互作用，造成释放RNA。

⒍何谓时序调控？何为适应调控？分别对原核生物和真核生物的转录调控举例加以说明。 答：在细胞的生长、发育和分化过程中，遗传信息的表达可按一定的时间程序发生变化，而且随着细胞内外环境条件的改变而加以调整，这就是时序调控和适应调控。

例子1：真核 RNA 聚合酶Ⅱ不能单独识别、结合启动子，而是先由基本转录因子 TF Ⅱ D 组成成分 TBP 识别 TATA 盒或启动元件，并有 TF Ⅱ A 参与结合，形成 TF Ⅱ D- 启动子复合物；继而在 TG Ⅱ AF 等参与下， RNA 聚合酶Ⅱ与 TF Ⅱ D 、 TF Ⅱ B 聚合，形成

一个功能性的前起始复合物。在几种基本转录因子中， TF Ⅱ D 是唯一具有位点特异的 DNA 结合能力的转录因子，在上述有序的组装过程起关键性指导作用。这样形成的前起始复合物尚不稳定，也不能有效启动 mRMA 转录。然后由结合在增强子上的转录激活因子直接或间接与 TF Ⅱ D 结合，从而影响前起始复合物的形成、稳定性以及 RNA 聚合酶的活性。

例子2：在没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻遏状态。此时，Ⅰ基因列在P启动序列操纵下表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，故阻断转录启动。阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对，偶有阻遏蛋白与O序列解聚。因此，每个细胞中可能会有寥寥数分子β半乳糖苷酶、透酶生成。当有乳糖存在时，乳糖操纵子即可被诱导。真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数β -半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构型变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使β-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。

⒎简要说明原核生物和真核生物转录调控的主要特点。 答：原核生物和真核生物转录调控的主要特点有： 原核生物功能相关基因常组织在一起构成操纵子，作为基因表达和调节的单位，真核生物不组成操纵子，每个基因都有自己的基本启动子和调节单元，单独进行转录，相关基因间也可进行协同调节；原核生物只有少数种类的调节单元，真核生物调节单元众多，包括组成型元件、可诱导元件以及增强子等；无论是原核还是真核生物，其转录受反式调节因子所调节；真核生物的转录调节涉及到染色质改型，原核生物不存在染色质水平的调节。

⒏转录调节因子的结构有何特点？

答：转录调节因子分类。转录因子，分为两类：①基本转录因子是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组因子，为所有mRNA转录起动共有②特异转录因子为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达，包括转录激活因子和抑制因子。

所有转录因子至少包括两个结构域：DNA结合域和转录激活域；此外，很多转录因子还包含一个介导蛋白质-蛋白质相互作用的结构域，最常见的是二聚化结构域。①DNA结合域通常由60－100个氨基酸残基组成。最常见的DNA结合域结构形式是锌指结构和碱性α螺旋。类似的碱性DNA结合域多见于碱性亮氨酸拉链和碱性螺旋-环-螺旋。②转录激活域——由30-100个氨基酸残基组成。根据氨基酸组成特点，转录激活域又有酸性激活域、谷氨酰胺富含区域及脯氨酸富含区域。③介导二聚化的结构域——二聚化作用与亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋结构有关。

⒐比较启动子上游元件增强子和绝缘子的作用特点。

答：增强子是远离转录起始点、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的DNA序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关，可位于转录起始点的上游或下游。从功能上讲，没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用。

绝缘子是一种长约几十到几百个核苷酸对的调控序列，通常位于启动子同邻近基因的正调控元件(增强子)或负调控元件(沉默子)之间(图5-22)。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。

⒑什么是染色质的结构域？它有哪些控制位点？

答：染色质上具有特定结构和功能的区域，叫染色质的结构域。它有3种类型的控制位点：

基因座控制区，绝源子，基质附着位点。

⒒目前有哪些重要的RNA合成抑制剂已在临床上用作抗癌药物抗病毒药物和治疗艾滋病的药物？其作用机制是什么？

答：目前在临床上应用的RNA合成抑制剂可分为3类，一是嘌呤和嘧啶类似物，如6 – 巯基嘌呤、5 – 尿嘧啶等，它们可作为核苷酸代谢颉颃物而抑制核苷酸前体的合成；二是DNA模板功能的抑制物如烷化剂、放线菌素等，它们通过与DNA结合而改变DNA的功能；三是RNA酶抑制剂，如利福霉素、利链菌素等，它们与RNA酶结合并影响其功能。

⒓为什么RNA转录后加工比任何生物大分子合成后的加工过程都更复杂？

答：由于RNA，特别是真核生物的RNA分子在转录后必须在其头和尾部加上帽子和多聚尾巴结构；5，端往往有调控序列，基因往往是被内含子隔断的断裂基因，在转录后必须进行剪切、拼接和重编码。因此与其它生物大分子相比，其合成后的加工过程都更复杂。

⒔试述的snoRNA结构和作用。 答：核仁小RNA（snoRNA），是近来生物学研究的热点，由内含子编码。富含AT，有boxC和boxD结构元素。核仁小RNA有多种功能，反义snoRNA指导rRNA核糖甲基化。 核仁小RNA与其它RNA的处理和修饰有关，如核糖体和剪接体核小RNA、gRNA等。核仁小RNA是一个与特性化的非编码RNA相关的大家族。

⒕为什么真核生物要先转录内含子然后再将其切除？ 此题目本身值得商榷，理由如下：

关于内含子的功能，有2种不同看法。一种见解认为，内含子是在进化中出现和消失的，内含子如果有功能，只不过是有利于物种的进化选择。例如细菌丢失了内含子， 可以使染色体变小和复制速度加快。真核生物保留内含子，则可以产生外显子移动，有利于真核生物在适应环境改变时能合成功能上有差异而结构上只有微小差异的蛋白质。另一些学者则力图证明内含子在基因表达中有调控功能。例如，现在已知道某些遗传性疾病，其变异是发生在内含子而不在外显子。有些内含子在调控基因表达的过程中起作用，有些内含子还能为酶编码。为了更精细地研究内含子，现在对内含子的分类有两种方法。 1．按基因的类型分为四类

第I类内含子：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因。 第Ⅱ类内含子：也发现于线粒体、叶绿体，但转录产物是mRNA。

I、Ⅱ类内含子中，已发现相当一部分是属于自身剪接的内含子，由RNA分子起酶的作用而催化剪接（见下述）。

第Ⅲ类内含子：是常见的形成套索结构后剪接的内含子，大多数mRNA的基因有此类内含子。

第Ⅳ类内含子：是tRNA的基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。

2．从中断基因线性表达的方式，有人又把内含子分为翻译前、翻译绕过、翻译后删除三种： 翻译前删除内含子：就是上述典型的、常见的内含子，在RNA加工中被除去；

翻译绕过式内含子：这些内含子不被剪接删除，但一般不翻译。在特定条件下却可翻译出有调控功能的、在原有外显子插入了一段氨基酸序列的蛋白质； 翻译后删除内含子：这是把蛋白质翻译后加工也算人内含子的概念中来。例如图1⒈17胰岛素的C肽是不存在于有活性的胰岛素分子上的，如按这一定义，C基因也可认为是内含子。类似的翻译后加工情况，在真核生物是很常见的。

⒖RNA拼接可分为哪几种类型？其作用特点是什么？ 答：RNA拼接的类型有：

（1）类型Ⅰ自我拼接。特点是只要1价、2价阳离子和鸟苷存在即可自行发生，无需供给能量和酶的催化。

（2）类型Ⅱ自我拼接。特点是能自我拼接，但不需要鸟苷。 （3）核mRNA拼接体的拼接。特点是由内含子自我催化完成。

（4）核tRNA的酶促拼接。特点是需要内切酶和连接酶等，需要消耗能量。

⒗RNA拼接和编辑对真核生物的进化有何作用？ 答：RNA拼接和编辑是在生物进化历史是形成的，RNA拼接和编辑可消除移码突变等基因突变的危害，增加了基因产物的多样性，还可能使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化。

⒘校正tRNA可以消除错义 、无义和移码突变带来的危害，但它是否会将正确的密码子翻译错误？

答：对基因或密码子反密码子上发生某种突变，能以\代偿\或校正原有突变所产生的不良后果的tRNA称为校正tRNA，这种tRNA上反密码子的突变称为校正突变。校正突变可为二类:一是发生在同一基因内，但不在该基因的同一部位，称为基因内突变校正(Intragenic suppression);二是发生在另一基因内，称为基因间突变校正(Intergenic suppression)。 在某些情况下，校正tRNA可能会将正确的密码子翻译错误。

⒙简要说明RNA功能的多样性。

答：RNA在遗传信息的翻译中起着决定作用；RNA具有重要的催化功能和其它持家功能；RNA转录后加工和修饰依赖于各类小RNA和其蛋白质复合物；RNA对基因表达和细胞功能有重要的调节作用；RNA在生物进化中起重要的作用。

⒚RNA复制酶如何调节病毒RNA复制与翻译 、正链与负链合成的关系？

答：又称RNA指导的RNA聚合酶，为以RNA为模板合成RNA的酶，存在于某些RNA病毒中，其底物和作用方式均与DNA指导的RNA聚合酶相似。 RNA聚合酶通常由多个亚基组成，有复杂的高级结构。RNA聚合酶是通过其高级结构的变化来调节病毒RNA复制与翻译 、正链与负链合成的。

⒛逆转录病毒前病毒的长末端重复是如何形成的？它有何意义？

答：逆转录病毒前病毒的长末端重复是在逆转录过程中，负链DNA重复合成U/3 – R/ - U5形成的。

这些长末端重复可帮助转录病毒以类似转座的方式整合进宿主DNA中。

21.为什么逆转座子只存在于真核生物中?它有何生物学意义？

答：在转座过程中需要以RNA为中间体，经逆转录再分散到基因组中的转座子，叫逆转座子。由于只有真核生物能完全满足逆转座子存在的条件（逆转录酶、整合酶，重复序列等），所以逆转座子只存在于真核生物中。

逆转座子的生物学意义：影响所在位点或邻近基因的活性；成为基因组的不稳定因素，促进基因重组；促进生物进化。

第37章 遗传密码

⒈DNA分子的哪些性质使其适宜作为遗传信息的携带物质？ 答：DNA是由4种脱氧核苷酸残基按一定顺序彼此用3’，5’-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DNA含有两条这样的长链，按腺膘呤与胸腺嘧啶配对、鸟膘呤与胞嘧啶配对的原则形成彼此互补的双中螺旋结构，因此，可以其中的任一条链为模版，复制出跟亲代一样的子代DNA链，将遗传信息传递给下一代；组成DNA的4种脱氧核苷酸，每3个组，可组成64个密码子，足以编码存在于生物中的氨基酸；另外，相较于RNA等其它生物大分子，DNA的理化性质比较稳定。

DNA分子的这些性质使其适宜作为遗传信息的携带物质。

⒉RNA的主要功能是什么？RNA转录后的一系列加工有何生物意义？

答：RNA的主要功能是通过转录和翻译，将生物贮藏在DNA中的遗传信息传递给蛋白质，从而实现遗传信息的生物学功能。

RNA转录后的一系列加工可使RNA转录后的初产物变成成熟的、有功能的RNA，有些加工还可改变RNA携带的遗传信息。

⒊Crick等如何证明遗传密码的基本单位是核苷酸三联体？

答：Crick等研究T4噬菌体 γⅡ位点 A和B 两个顺反子变异的影响， 这两个基因与噬菌体能否感染大肠杆菌κ菌株有关。 吖啶类染料是扁平的杂环分子，可插入DNA两碱基对之间而引起DNA插入或丢失核苷酸。 该位点缺失一个核苷酸或插入一个核苷酸的突变体 缺失两个 或 插入两个核苷酸的突变体重组得到的重组体是严重缺陷性的，不能感染大肠杆菌κ菌株，该位点缺失三个核苷酸或插入三个核苷酸的突变体能表现正常的功能，但该位点缺失四个核苷酸或插入四个核苷酸的突变体却是严重缺陷性的。据此，Crick等证明遗传密码的基本单位是核苷酸三联体。

⒋如何理解基因与蛋白质的共线性？RNA的拼接 、剪辑与再编码对共线性概念有何影响？ 答：根据“中心法则”，基因中DNA的组成顺序决定了转录后RNA的组成顺序，RNA的组成顺序决定了翻译成的蛋白质的组成顺序，这就是基因与蛋白质的共线性关系。

RNA的拼接 、剪辑与再编码可能会改变基因携带的遗传信息的表达，产生新的遗传信息，纠正译码环节的一些错误，是对基因与蛋白质的共线性关系的发展和补充。

⒌遗传密码是如何破译的？

答：第一个用实验给遗传密码以确切解答的是德国出生的美国生物化学家尼伦贝格（M.W.Nirenberg，1927—）。1961年他和另一位德国科学家马太（Heinrich Matthaei）在美国国家卫生研究院的实验室内发现了苯丙氨酸的密码是RNA上的尿嘧啶（UUU）。他们在用大肠杆菌的无细胞提取液研究蛋白质的生物合成问题时发现：当向这个提取液中加进核酸，则合成了蛋白质；当用由单一的尿嘧啶组成的核酸长链加进这个提取液中，则产生了由单一苯丙氨酸组成的多肽长链。这个结果立即震动了科学界。但是测定其他氨基酸的密码需要各种各样的碱基组合，而当时这种组合并不是很容易得到的，它需要一种多核苷酸磷酸化酶。美国另一位西班牙血统的生物化学家奥乔亚（Ochoa，Severo，1905—）于1955年发现了多核苷酸磷酸化酶（PNP酶）帮助了尼伦贝格合成了同聚核苷酸——多聚U（PolyU）（奥乔亚因发现此酶而获得1959年诺贝尔生理学或医学奖）。当他将多聚U作为模板加入到无细胞

体系中时，那就是只有加有标记苯丙氨酸所产生的那一试管蛋白质沉淀具有放射性。而加其他标记氨基酸的各管则均无放射性进入沉淀。于是，第一个密码便被破译出来，即UUU是苯丙氨酸的密码子。用同样的方式以其他多聚核苷酸作为模板，又测出CCC是脯氨酸的密码子，AAA是赖氨酸的密码子。多聚G的氨基酸密码子当时用此法测定时遇到困难，未能测出。

在取得第一阶段突破性成果之后，尼伦贝格用混合的核苷酸制备人工合成的mRNA模板，分别测试其作用。

用2种或3种不同的核苷酸制备mRNA模板时，PNP酶合成的产物都是杂聚物，其中核苷酸的顺序是随机的，无法预测。但各种三联体出现的相对几率则是可以推算出来的。在测定了各种标记氨基酸参入蛋白质的量之后，将其相对参入量和三联体出现的几率加以比较，即可知道每种三联体相对应的是那一种氨基酸。 此法的应用有局限性，密码子中不同核苷酸的比例固然可以推测出来，但是它们的排序却不能确定；尽管如此编码的范围还是大大缩小了。后来又发现有些密码子具有重复性，即一种氨基酸可以有多种密码子，但是每一种密码子只编码一种氨基酸。 为了搞清密码子中核苷酸顺序，尼伦贝格巧妙地设计了第三阶段的实验。他采用的是核糖体结合法新技术，并加入的模板一律改为具有一定顺序的单个三联体。实验仍在无细胞体系中进行。他们的小组合成了全部64种单个的、顺序固定的三联体密码。实验结果能使50种密码子所对应的氨基酸能确定下来。实验中发现，有三个密码子并不编码任何氨基酸，后来知道它们是终止信号。还知道甲硫氨酸的密码子可兼作起始信号。完整的密码子表，到1963年由与尼伦贝格共获1968年诺贝尔生理学或医学奖的霍拉纳（Khorana，Har Gobind，1922—）利用其他技术加以确定的。

⒍何谓密码的简并行和变偶性？二者有何关系？ 答：同一种氨基酸有两个或多个密码子的现象，叫密码的简并性。tRNA上的反密码子与mRNA密码子配对时，密码子第一位、第二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定的变动，这种现象，叫变偶性。

变偶性可理解为是对密码的简并性的一种修正。

⒎为什么只要32种tRNA就能识别通用遗传密码中61个编码氨基酸的密码子？而在线粒体中只要22种tRNA就能识别全部氨基酸的密码子？

答：由于密码子变偶性的存在，只要32种tRNA就能识别通用遗传密码中61个编码氨基酸的密码子。

在线粒体中只要22种tRNA就能识别全部氨基酸的密码子，这是由于密码的通用性和变异性造成的。

⒏何谓密码的通用性和变异性？试分析线粒体遗传密码的特点。

答：密码的通用性是指不同的生物密码子基本相同，即共用一套密码子。密码的变异性是指线粒体DNA(mtDNA),还有原核生物支原体等少数生物基因密码有一定变异。

哺乳动物mtDNA的遗传密码与通用遗传密码有以下区别：UGA不是终止信号，而是色氨酸的密码；多肽内部的甲硫氨酸由AUG和AUA两个密码子编码，起始甲硫氨酸由AUG，AUA，AUU和AUC四个密码子编码；AGA，AGG不是精氨酸的密码子，而是终止密码子，线粒体密码系统中有4个终止密码子（UAA，UAG，AGA，AGG）；有4组密码子其氨基酸特异性只决定于三联体的前两位碱基，它们由一种tRNA即可识别；线粒体密码子特殊的变偶规则使它只要22种tRNA就可识别全部的氨基酸。

⒐为什么遗传密码的编排具有防错的效果？

答：在遗传密码表中，氨基酸的极性通常由密码子的第二位碱基决定，简并性由第三位碱基决定。这种分相使得密码子中一个碱基被更换，其结果或是仍然编码欺上相同的氨基酸，或是以理化性质最接近的氨基酸取代。从而将基因突变的危害降至最低程度，即这样的编排有一定的防错效果。

⒑举例说明遗传密码的翻译受上下文的影响。

答：在有些情况下，密码子的含义可随上下文的不同而改变。如在大肠杆菌中，有时缬氨酸密码子GUG和亮氨酸密码子UUC也可被用作起始密码子，当其位于特殊mRNA翻译的起始位置时，可被起始tRNA所识别。

第38章 蛋白质合成及转运

⒈mRNA的概念是如何形成的？如何证实的？ 答：（一）信使RNA概念的提出

信使RNA(messenger RNA, mRNA)的发现在分子生物学的发展中是一重大事件。由于其在细胞总RNA中所占比例很小，很难把它分离出来。mRNA的概念首先是从理论上提出来的，然后再用实验得到证实。F. Jacob和J. Monod早在1961年就提出mRNA的概念。他们认为，既然蛋白质是在胞质中合成的，而编码蛋白质的信息载体DNA却在胞核内，那么必定有一种中间物质用来传递DNA上的信息。他们在研究大肠杆菌中与乳糖代谢有关酶类的生物合成时发现，诱导物如异丙基硫代半乳糖苷(β-isopropylthiogalaotoside， IPTG)的加入，可以立刻使酶蛋白的合成速度增加上千倍。而诱导物一旦消失，又可使酶蛋白的合成立刻停止。这个实验结果给人的启示是：蛋白质合成的模板是一种不稳定的物质，其半衰期很短。他们对这种信使物质的性质作了如下的预言： a．信使是一种多核苷酸；

b．信使的碱基组成应与相应的DNA的碱基组成相一致；

c．信使的长度应是不同的，因为由它们所编码的多肽链的长度是不同的； d．在多肽合成时信使应与核糖体作短暂的结合；

e.信使的半衰期很短，所以信使的合成速度应该是很快的。

所以，这样的信使可能是一种RNA。但是当时已发现的两种RNA（rRNA、tRNA）都不具备这些特性。各种生物的核糖体RNA的大小差异不大，碱基组成的变化也不大。tRNA除了有与rRNA相同的问题以外，它们的分子也太小。所以这两种RNA都不能胜任信使的功能。可喜的是当时已有人提出过，细胞内有可能存在第三种RNA。在被噬菌体T2感染后的大肠杆菌中，有人发现有一种新的RNA，它的代谢速度极快，分子大小也参差不齐，碱基组成又与T2DNA相一致。这些特征都符合信使分子的要求。 (二)信使RNA的实验证明 信使RNA的概念提出后，还必须要用实验来证明这种概念是否正确。为此，S.Brenner，F. Jacob和M. Monocl等人设计了一组实验。用噬菌体T2感染大肠杆菌后，发现几乎所有在细胞内合成的蛋白质都不再是细胞本身的蛋白质，而是噬菌体所编码的蛋白质；这些蛋白质的合成速度与细胞总RNA的合成速度无关；T2感染后不久，细胞中出现了少量半衰期很短的RNA，它们的碱基组成与DNA是一致的。上述这些特性都与他们预言的信使分子特性十分符合。 那么噬菌体的感染又是怎样将细胞内蛋白质合成的方向改变了呢?当时曾提出了两种假设。一种认为T2的感染引起了一类新的核糖体的合成，不同的核糖体控制不同的蛋白质的合成；

另一种假设认为核糖体并不具有这种特异性，它的功能只不过是从mRNA接受遗传信息而已。Brenner，Jacob，Meselson等人支持后一种看法。于是他们又设计了一组实验来解决这个问题。

他们将大肠杆菌接种在含有重标记(15N和13C)的培养基上，再用T2感染。感染后立刻将细菌转移到含有轻同位素(14N和12 C)的培养基上。再将T2感染前与感染后的细菌破碎，分离出核糖体，用密度梯度超离心技术将带有重同位素的核糖体与带有轻同位素的核糖体分开。他们还用32P或用14C-尿苷去标记RNA，并用35S-甲硫氨酸去标记新合成的蛋白质。这些实验表明：

a．T2感染后并无轻标记核糖体出现，说明在T2感染后并未引起新核糖体的合成。

b．T2感染后，诱发了新的RNA的合成。大多数放射性标记的RNA出现在重标记核糖体中。这种新合成的RNA代谢速度极快。

c．35S标记的蛋白质只暂时出现在重标记核糖体中，说明新合成的蛋白质是在早就存在的核糖体中合成的。

以后，S. spiegelman又用分子杂交技术证明：经T2感染后的新合成的RNA可以与T2DNA相杂交，但细胞内的其他RNA则不能与T2DNA杂交。

⒉核糖体的基本结构与功能有哪些？

答：核糖体有的游离在胞质中,称为游离核糖体(free ribosome)。 有的附着在内质网表面,参与构成RER,称为固着核糖体或膜旁核糖体（fixed Ribosome）。

无论哪种核糖体,在执行功能时,即进行蛋白质合成时,常3-5个或几十个甚至更多聚集并与mRNA结合在一起,由mRNA分子与小亚基凹沟处结合,再与大亚基结合,形成一串,称为多聚核糖体(游离多聚核糖体及固着多聚核糖体),Polyribosome或Polysome。

核糖体是由大、小二个亚基组成的不规则颗粒。大亚基侧面观是低面向上的倒圆锥形,底面不是平的,边缘有三个突起,中央为一凹陷,似沙发的靠背和扶手。 小亚基是略带弧形的长条,一面稍凹陷,一面稍外突,约1/3处有一细缢痕,将其分成大小两个不等部份。 小亚基趴在大亚基上,似沙发上趴了一只小猴。大小亚基凹陷部位彼此对应相结合,就形成了一个内部空间。此部位可容纳mRNA、tRNA及进行氨基酸结合等反应。

此外,在大亚基内有一垂直的通道为中央管,所合成的多肽链由此排放,以免受蛋白酶的分解。 一般真核细胞中,106-107个/细胞,原核细胞中15-18× 103个/细胞,蛋白质合成旺盛的细胞可达1×1012个/细胞。

核糖体是蛋白质合成的场所。单个核糖体上存在四个活性部位,在蛋白质合成中各有专一的识别作用：A部位，氨基酸部位或受位:主要在大亚基上,是接受氨酰基-tRNA的部位；P部位，肽基部位或供位:主要在小亚基上,是释放tRNA的部位；肽基转移酶部位(肽合成酶),简称T因子，位于大亚基上,催化氨基酸间形成肽键,使肽链延长；GTP酶部位，即转位酶,简称G因子,对GTP具有活性,催化肽键从供体部位→受体部位。

另外,核糖体上还有许多与起始因子、延长因子、释放因子以及各种酶相结合的位点。

⒊假定以下列mRNA片断为模板，合成的多肽有何氨基酸序列: 5'GGUUUCAUGGACGAAUAAGUGAUAAUAU3'

答：根据不同的阅读框，该mRNA片断合成的多肽氨基酸序列有: 1 GGU UUC AUG GAC GAA UAA GUG AUA AUA 27 1 Gly Phe Met Asp Glu End Val Ile Ile

2 GUU UCA UGG ACG AAU AAG UGA UAA UAU 28

1 Val Ser Trp Thr Asn Lys End End Tyr

3 UUU CAU GGA CGA AUA AGU GAU AAU 26 0 Phe His Gly Arg Ile Ser Asp Asn 7

⒋按下列单链：

5'TCGTCGACGATGATCATCGGCTACTCG3' 试写出

① DNA复制时，另一种单链的序列； ② 转录成的mRNA序列； ③合成的多肽序列。

答：① DNA复制时，另一种单链的序列：CGAGTAGCCGATGATCATCGTCGACGA ② 转录成的mRNA序列：UCGUCGACGAUGAUCAUCGGCUACUCG ③合成的多肽序列：

1 UCG UCG ACG AUG AUC AUC GGC UAC UCG 27 1 S S T M I I G Y S

若按第2阅读框翻译，中间有终止密码子，故不可能按这种方式合成多肽。 3 GUC GAC GAU GAU CAU CGG CUA CUC 26 0 V D D D H R L L 7

⒌试设想一下，在转译过程中，在哪些环节上保证了所合成的多肽的正确无误？ 答：转译又称“翻译”。即以信使RNA为模板，合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。转译的过程是：细胞核中DNA的某一区段转录出来的mRNA从核孔穿出来进入细胞质中，与核糖体结合起来进行蛋白质的合成。

在转译过程中，在这些环节上保证了所合成的多肽的正确无误：每一氨酰-tRNA合成酶识别一个特定的氨基酸和与此氨基酸对应的tRNA；氨酰-tRNA合成酶纠正酰化的错误；起始tRNA 识别翻译的起始点；tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对，确保合成氨基酸顺序的正确性。

⒍氨酰-tRNA合成酶有何功能？

答：氨酰-tRNA合成酶的功能是将正确的氨基酸装载到相应的tRNA分子上。

⒎tRNA有何功能？

答：在蛋白质生物合成过程中，tRNA主要起转运氨基酸的作用。

⒏嘌呤霉素如何抑制蛋白质合成？

答：嘌呤霉素(puromycin;PM ) 是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构, 能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到生长的肽链中。虽然嘌呤霉素能够同A位点结合,但是不能参与随后的任何反应, 因而导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。

⒐在蛋白质定向输送时，多肽本身有何作用？

答：在蛋白质定向输送时，每一需要运输的多肽都含有一段氨基酸序列，称为信号肽序列，引导多肽至不同的转动系统。

使其变成平齐末端后，也可用 T4 DNA连接酶进行有效的连接。其三，可采用附加衔接物（linker，是一种人工合成的双链DNA短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体DNA上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接）的方法，提高平齐末端间的连接作用效率。其四，可利用接头进行DNA平齐末端门的连接。接头（adaptor）是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。 这些方法是在不同的情况下发挥作用的，谈其所谓的“优点”有些牵强。应根据具体研究对象的特点和研究目的，灵活选用。

⒎将重组DNA导入细胞内有哪些方法？它们的原理是什么？

答：根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染、感染和注射等不同手段。

：①转化，用质粒作载体所常用的方法。②转染，用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。③转导，用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。④注射，如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。

⒏基因文库和cDNA文库有何不同？为什么要建立cDNA文库？

答：基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。

真核生物的基因是断裂的，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起；真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有加工成熟的mRNA经逆转录合成的cDNA接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达；另外，真核生物细胞中只有一小部分mRNA进行表达，mRNA的稳定性差。因此，需要构建cDNA文库，用于基因表达等方面的研究。

⒐建立人胚cDNA文库，以致人胚低丰度mRNA为28 000种，占总mRNA的40%，为使低丰度cDNA存在的概率大于99%，此文库应包含多少克隆？ 答：3.2×105。

⒑原位杂交的原理是什么？有何用途？

答：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。

利用原位杂交，可在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位；可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。

⒒何谓差别杂交和扣除杂交？举例说明用以分离基因的过程。

答：差别杂交（differential hybridization）又叫差别筛选（differentual screening），适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA之cDNA克隆。为了增加这种方法的有效性，后来又发展出了扣除杂交技术。扣除杂交（subtractive hybridization）又叫扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通过构建扣除文库（subtractive library）得以实现的。

差别杂交的技术基础需要有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA

种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA（或是它们的cRNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落，供作进一步研究使用。

扣除杂交是用一般细胞的mRNA与特殊细胞的cDNA杂交，先扣除一般共有的cDNA，再交剩下特异的cDNA进行克隆。

下面以T 细胞受体（T-cell receptor，TCR；有时亦称之为T细胞抗原受体）编码工因的分离为例子，说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。 TCR基因只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。从T细胞mRNA制备来的单链cDNA，同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA-RNA杂交的条件下保温，所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子（约占98%），都能与B细胞的mRNA退火形成DNA-RNA杂交分子，而不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA（约占2%），由于B细胞中没有相应的mRNA，仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱（hydroxylapatite column），于是DNA-RNA杂交杂分便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。如此回收入到的T细胞特异的cDNA被转变为双链cDNA之后，与适当的λ噬菌体载体重组并转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞持cDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备扣除的cDNA探针，即被B细胞mRNA杂交扣除了的T细胞特异的cDNA探针，筛选文库，结果成功地分离到了T细胞的TCR基因。

⒓说明聚合酶链式反应(PCR)的原理和用途。

答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途： (1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量mRNA生成 cDNA文库； (3) 从cDNA中克隆某些基因；

(4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移；

(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

⒔基因定位诱变的主要方法有哪几种？它们的原理是什么？

答：基因定位诱变的主要方法有酶切诱变、寡核苷酸指导的诱变和PCR诱变。 酶切诱变：利用基因的酶切位点，在切点处改造基因序列。

寡核苷酸指导的诱变：利用克隆技术将人工合成的寡核苷酸片段插入到目的基因的序列中。 PCR诱变：通过PCR引物在扩增片段的两端引入各种变异，嵌套式PCR还可以在基因内部或在一次PCR中同时在多处引入变异。

⒕比较两种DNA快速测序的方法，包括方法的原理和优缺点。 答：目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的双脱氧法（酶法）及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法。虽然其原理大相径庭，但这两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。 Sanger法DNA测序

Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 Sanger 法测序快速、省事，不需要比强很高的32P-dNTP,但有时会出现一些不够清晰的结果。 Maxam－Gilbert DNA化学降解法

化学降解法的原理是首先标记双链DNA的5’端，然后加入二甲基亚砜并加热到90°C，使双链DNA分子变成单链。通过凝胶电泳分离两条链，其中一条链含有更多的嘌呤成为重链，另一条链为轻链。纯化两条链，分成四份，分别利用不同的降解试剂进行降解（哌啶,氮杂环己烷），产生了一系列的降解片段。可以通过电泳分离显示出来。 化学降解法可以提供比较清晰的结果，但步骤繁琐，许多药品有剧毒。

⒖基因表达的主要控制元件有哪些？真核生物和原核生物有何差别？

答：基因表达的主要控制元件有启动子、核糖体结合位点、转录终止信号等。 启动子：原核启动子约55bp,分为起始点（start site）、结合部位、识别部位。起始点：转录起始部位以+1表示，转录的第1个核苷酸常为嘌呤---G,A。结合部位：约6bp组成,是高度保守区,共有序列为5'-TATAAT-3' ,位于起始点上游-10。因Tm低,DNA易解开双链，为RNA聚合酶提供场所。识别部位：约6bp组成,在-35处,为高度保守区,序列5'-TTGACA-3', s因子识别此部位。

真核启动子于-25处含AT富集区, 共有序列为TATAA（TATA box），-70处含共有序列CAAT ,还含许多其它box ,例如 GC box,E-box等。含增强子(enhancer)和静息子(silencer) RNA polⅠ和 RNA polⅢ与聚合酶Ⅱ所识别的启动子差异较大。

核糖体结合位点：在大肠杆菌等原核生物mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始

密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。

转录终止信号：在一个基因的3’端或是一个操纵子的3，端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子(terminator)。原核生物终止信号在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种，一种只取决于DNA的碱基顺序；另一种需要终止蛋白质(p因子)的参与。

真核生物转录终止序列，在3'端之后有共同序列AATAAA及多个GT序列，mRNA在转录终止序列处被切断。

⒗分析融合蛋白表达和非融合蛋白表达的利弊。 答：融合蛋白表达和非融合蛋白表达的利弊：外源基因的活性蛋白质第一个氨基酸可能不是蛋氨酸，在表达时需要加上蛋氨酸的密码子，有时外加的蛋氨酸会影响产物活性；蛋白质的N端序列对其合成和折叠有较大影响，将外源基因编码序列与宿主细胞高表达基因N端序列融合，以融合蛋白形式表达可以提高表达水平；外源蛋白在宿主体内往往不够稳定，易被宿主细胞蛋白酶降解，含有宿主蛋白N端序列的融合蛋白则比较稳定；融合蛋白不影响某些表位结构，而易进行抗体工程；与某些特定多肽和蛋白质融合易于分离纯化和检测。

⒘酵母的克隆载体有哪几种？它们的基本特点是什么？

答：酵母菌载体 (Yeast vector) 依其能否独立复制可分为结合载体和复制载体。它们的基本特点是：

结合载体（Integrating vector）：载体没有复制序列，必须嵌入酵母菌的染色体内才能随着细胞分裂时分裂。一般用作制备基因文库用。 复制载体（Replicating vector）：载体有与复制相关的序列，依其复制序列种类可分为： (1) 2 μ 质粒：从酵母菌天然的质粒上截取一段包含复制序列的 2μ DNA。 其优点是非常稳定，可确保细胞分裂时，质粒的性状可移交到子代中不遗失。

(2) ARS 质粒：从酵母菌的染色体中截取一段ARS 片段。ARS是表示Autonomously replicating sequence。ARS 质粒的稳定性较差，质体常被分解而无法代代相传。但是若加入一段着丝粒序列（centromere sequence ），变成CEN 质粒，就可使质粒稳定性提高，但CEN 质粒的拷贝数较低，一般为单拷贝。

(3)酵母人工染色体(YAC ，yeast artificial chromosome)，这种载体除了上述ARS, CEN序列外，两端再加上端粒序列，形成彷彿就是染色体般的外观，故名之。

其特性是容量 (capacity) 超大，可承载 0.2 - 2.0 Mb DNA的长度。多被用于构建基因组文库用。

⒙如何将外源基因导入植物细胞并使之表达？

答：外源基因导入植物细胞并使之表达的方法，分为载体法和直接法两类。载体法是目前最常用的一种方法，最初的载体是土壤农杆菌中的原质粒，在原质粒上有一段DNA，即T-DNA，在土壤农杆菌浸染植物细胞时，T-DNA能够插入植物细胞的基因组中，且能稳定地遗传给其后分离出来的细胞，载体法的优点是操作简便，遗传表达比较稳定，但这些载体仅适用于双子叶植物基因。直接法是将目的基因直接导人受体的细胞中，它包括以原生质为受体的化学转化法，如PEG(聚二乙醇)它以聚二乙醇为融合剂将异源原生质融合在一起，即原生质融合法。磷酸钙-PEG，改良的原生质融合法。电击穿孔法，就是通过很高的电压，迅速将细胞膜

的一部分打开，使外源DNA进入原生质体中。显微注射法，就是直接用注射针位射到细胞里。

⒚什么是基因治疗？常用的载体有哪几种？

答：所谓基因治疗（gene therapy）是指向受体细胞中引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，也可以是利用引入基因以杀死体内的病原体或恶性细胞。

基因治疗中的载体有病毒载体和非病毒载体。其中常用的病毒载体有：反转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体和疱疹病毒载体等；常用的非病毒载体有：裸DNA、脂质体/DNA复合物、多聚物/DNA复合物等。

⒛什么是蛋白质工程？举例说明蛋白质工程的意义。

答：蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。 蛋白质工程也具有广泛的应用前景

比如在医学上，用人工手段去改造某些致癌基因的产物——蛋白质，使它失去致癌作用，从而开辟治疗癌症的新途径。我国的蛋白质工程具有国际先进水平，这些工程包括重组人胰岛素和溶血栓药物，重组人尿激酶等。

在食品工业、日用品工业方面，用经过改造的稳定性好的酶，可由价格便宜的棕榈油生产出价格昂贵的可可脂，从而创造很高的经济效益。荷兰一家公司设计了一种能和漂白剂一同起作用的去污酶，并且通过对这种酶上的两个氨基酸的修改，使这种酶具有较高抵抗力，在洗涤过程中不受破坏。因此，通过蛋白质工程可实现常规酶工程手段不能实现的目标。 对动植物体内参与重要生命活动的酶加以修饰和改造，是蛋白质工程未来发展的一个重要目标。有朝一日，人们一定能够通过蛋白质工程来设计、控制那些与DNA相互作用的调控蛋白质，到那时，人为控制遗传、改造生命就不再是天方夜谭了。

21.叙述DNA改组的步骤和原理。

答：DNA改组是指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(sexual recombination)。通过改变单个基因(或基因家族， gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 DNA改组的步骤和原理：

（1）错误倾向PCR：通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度,或使用低保真度的DNA聚合酶等,使碱基在一定程度上随机错误引入而创造序列多样性文库。

（2）自身引物PCR：DNA片段重叠部分两互补链的3‘端彼此配对，各作为引物，以互补链为模板向前延伸，然后以同样的方式与互补链配对延伸，直至合成全长的基因。

（3）重组合PCR：用基因5、和3、端引物将上述经重组合的全长基因扩增出来，即可用于表达和选择。

22.提出你对基因工程未来发展的看法。

答：基因工程开辟了生物学研究的新纪元，带动了生物技术产业的兴起。概括地讲，基因工程未来发展是前途光明，道路曲折。

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