生物化学与分子生物学实验指导-

生物化学与分子生物学实验汇编

实验五 基因重组

一、实验目的

学习和掌握DNA重组连接和鉴定重组子的方法和技术

二、实验原理

经过Taq酶扩增的PCR产物末端都带有一个突出的3’-A，pUCm-T载体具有5’ -T末端，可以与产物3’-A配对而连接，因此带有3’-A末端的PCR产物可以直接用pUCm-T载体进行克隆连接。pUCm-T具有多个MCS单切点和半乳糖苷酶阅读框及氨苄青霉素抗性基因，具有抗生素筛选和蓝白斑筛选特性，是一种新颖的T载体。

判断外源基因是否连入载体方法：（蓝白斑筛选）当外源基因插入到pUCm-T载体中后，由于外源DNA的核酸序列的存在改变了lacZ基因的开放式阅读框，从而影响了其产物半乳糖苷酶的活性，因此无法分解培养基上的X-gal，菌落呈白色，而没有连接入载体的lacZ开放式阅读框没有改变，其产物半乳糖苷酶将X-gal分解产生蓝色菌落。

判断转化是否成功方法：由于T载体具有Ampr特性，未转化细菌无法在含有氨苄青霉素培养基上生长，转化菌则能在含氨苄青霉素培养基上生长。

三、仪器、材料和试剂

（一）仪器

1、恒温摇床 2、离心机 3、恒温水浴 4、恒温培养箱 （二）材料

1、感受态细胞（实验四中制备） 2、 氨苄青霉素 3、T-载体克隆试剂盒 4、X-gal

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5、IPTG 6、蛋白胨 7、酵母膏 8、NaCl 9、琼脂 10、1.5mL离心管 11、200μL PCR管 12、试管、吸头、锥形瓶等

（三）试剂

1、LB液体培养基见实验四 2、LB固体培养基

在LB液体培养基中加入15g琼脂，121℃高压灭菌20min。

3、10mg/mL X-gal：溶于二甲基甲酰胺，无需过滤灭菌，分装成小包装，避光贮存于-20℃。 4、200mg/mL IPTG：取2gIPTG溶于8mL ddH2O中，再用水补至10mL，用0.22um滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20℃。

5、50mg/mL Amp：用灭菌水配制，无菌滤器过滤，贮存于-20℃。

四、实验步骤

（一）载体与目的基因连接 配制10μL反应体系 Ligation buffer 1μL T载体 0.5μL PCR产物 1μL DNA ligase 0.5μL ddH2O 7μL 在16℃水浴恒温反应1h。 （二）选择性培养平板的制备

1、加热融化LB固体培养基，待培养基降温至60℃，加入氨苄青霉素至终浓度50μg/mL，倒平板。

2、待平板凝固后，取200mg/mL IPTG 4μL，10mg/mL X-gal（溶于二甲基甲酰胺）80μL和混匀后在平板上均匀涂布。

（三）转化

1、取实验四制备的感受态细胞，置于冰上，轻轻将细胞均匀悬浮。 2、加入10μL实验步骤（一）中连接反应产物，轻轻混匀，冰浴30min。 3、迅速移入42℃水浴中，热激90s（严格计时）。 4、冰浴2min。

5、将上述反应液加入到含400μL LB培养液的1.5mL离心管中，37℃200rpm 振荡复

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苏培养30min。

6、将复苏菌液4000rpm离心1min，先吸去400μL上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取100μL细胞悬液直接涂布在含50μg/mL氨苄青霉素、100μg/mL X-gal和100 μg/mL IPTG的LB选择性培养基上。

7、将培养皿正向放置30min至液体被吸收，后倒置平皿37℃培养16~20h出现菌落，其中白色菌落为目的基因重组菌（可适当于4℃放置几小时以使蓝白斑明显）。

五、实验结果

图3 蓝白斑筛选菌落

六、思考题

1、出现蓝色、白色菌落各说明什么问题？

2、蓝白斑筛选时往往会出现16~20h内并不出现菌落，但坚持培养一段时候后会（如培养了30h）出现白色菌落，请问白色菌落是重组子吗，并分析为什么会出现这种情况？

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主 要 参 考 文 献

1. Rodney F. Boyer, Modern Experimental Biochemistry, Addison-Wesley Publishing Company,

Inc., 2000

2. Keith Wilson and John M. Walker, Principles and techniques of practical biochemistry, Fourth

edition, Cambridge University Press, 1994

3. Robert L. Dryer and Gene F. Lata, Experimental Biochemistry, Oxford University Press, 1989 4. Daniel M. Bollag and Stuart J. Edelstein, Protein Methods, A John Wiley & Sons, Inc., 1991 5. 李建武等合编，生物化学实验原理和方法，北京大学出版社，1994年

6. 张龙翔，张庭芳，李令媛主编，生化实验方法和技术（第二版），高等教育出版社，1997

年

7. 赵永芳编著，生物化学技术原理及其应用（第二版），武汉大学出版社，1994年 8. 苏拔贤主编，生物化学制备技术，科学出版社，1994年

9. 张立名，王贤舜编著，现代生物化学原理，中国科学技术大学出版社，1991年 10. 卢圣栋主编，现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年 11. 何忠效，张树政主编，电泳（第二版），科学出版社，1999年 12. 郭尧君编著，蛋白质电泳实验技术，科学出版社，1999年

13. 师治贤，王俊德编著，生物大分子的液相色谱分离和制备，科学出版社，1999年 14. J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇, T.曼尼阿蒂斯著，金冬雁, 黎孟枫等译，分子克隆实验指南（第

二版），科学出版社，1999年

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1. 绪论

生物化学与分子生物学实验属于化学类实验。对于大多数学生来说，这不是第一次做化学类的实验，但是生物化学与分子生物学实验一定是大家最感兴趣、最激动人心的实验，当然也是花费最大、最辛苦的实验。同学们在过去几年中所学到的各种实验技术和操作技能，在这些实验中将会经常用到，当然更重要的是要学会一些新的科学研究中常用的实验方法。同学们在生物化学与分子生物学实验方面要取得好成绩，在很大程度上，取决于你们对这些专门化实验技术的熟练掌握和对生物化学原理的深入了解。

当同学们进行实验时，无疑将会与以前做的各种实验进行比较。在生物化学实验中，大家会发现，极少有像无机化学和有机化学实验那样进行化学反应和分离出―克‖数量级的产物。同学们将进行的是―毫克‖和―微克‖数量级的研究，并且在多数情况下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物质，但是将会看到动态的生物化学过程和由生物分子引起的化学变化。实验中所用到的各种技术和方法，将起到―眼睛‖的作用，用以对各种生物化学过程进行监测。

同学们通过生物化学实验应该做到：①学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。②训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种实验仪器，包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、自动部分收集器、恒流泵、核酸蛋白检测仪、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、高速分散器、各种电泳装置和摇床等等。③学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。④掌握生物化学与分子生物学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。

预祝同学们以优异的成绩跨进这一新的科学殿堂，成为攀登生物科学高峰的新的勇士！

1.1 生物化学与分子生物学实验技术发展简史

生物科学在20世纪有惊人的发展，其中生物化学与分子生物学的进展尤为迅速，这样一门最具活力和生气的实验科学，在21世纪必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化学与分子生物学实验技术的不断发展和完善。这里我们简单回顾一下生物化学实验技术的发展历史。

20年代： 微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了―超离心技术‖，1924年制成了第一台5000×g（5000 r/min～8000 r/min）相对离心力的超离心机(相对离心力―RCF‖的单位可表示为―×g‖)，开创了生化物质离心分离的先河，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。 30年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和生物大分子的内部结构。

40年代： 层析技术大发展，两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。 ―电泳技术‖是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。

50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，―放射性同位素示踪技术‖在50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。

60年代： 各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman

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设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动测定仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。 1962年，美国科学家Watson和英国科学家Crick因为在1953年提出的DNA分子反向平行双螺旋模型而与英国科学家Wilkins分享了当年的诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X-射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型，他们的研究成果开创了生物科学的历史新纪元。在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。

此外，在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968—1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取得了重大进展。

70年代： 基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。

80至90年代： 基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。 1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。

1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。

1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了PCR技术（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖。 除上述历史以外，还可以列出许多生物化学与分子生物学发展史上的重要成就，例如： 美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授对生物化学常用的各种分析方法（血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等）的建立作出了历史性的贡献。

美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，他获得了诺贝尔化学奖。

英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。 英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的精确顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。

1959年，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg分享了当年的诺贝尔生理医学奖，而后者的主要贡献在于实现了DNA分子在细菌细胞和试管内的复制。 美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙

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氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana曾合成了精确结构的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。 法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。

1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。

1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。

1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。

1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。

1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40～70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。 我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。 由近百年来生物化学及其实验技术的发展史可以看出，该学科的发展与实验技术的发展密切相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明都大大推动了生物化学研究的进展，因而对于每一位现代生物科学工作者，尤其是生物化学工作者，学习并掌握各种生物化学实验技术就是极为重要的。

1.2 实验室规则

⑴ 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理，写好实验预习报告，否则，不能进行实验。

⑵ 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。

⑶ 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。

⑷ 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。

⑸ 配制试剂和用无离子水要注意节省，按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，昂贵的Sephadex、Sepharose凝胶和DEAE纤维素等，用后必须及时回收，不得丢弃。

⑹ 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。 ⑺ 配制和使用洗液必须极为小心，强酸强碱必须倒入废液缶或冲稀后排放。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。

⑻ 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。使用高速冷冻离心机和HPLC等大型仪器必须经过考核。仪器发生故障应立

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实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

一、实验目的

学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

二、实验原理

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场总向正极移动。由于核糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同相对分子量的DNA片段迁移速率不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速率与相对分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳也可分离分子量相同，但构型不同的DNA分子。一般对质粒而言，超螺旋环型DNA迁移最快，其次为线状DNA分子，最慢为开环DNA分子（有时随电泳条件变化）。

三、仪器、材料和试剂

（一）仪器

1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、凝胶成像系统 （二）材料

1、DNA模板 2、PCR产物 3、琼脂糖 4、EDTA 5、硼酸 6、EB 7、Tris-HCl 8、溴酚蓝 9、蔗糖 （三）试剂

1、5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）1000mL Tris HCl 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 20mL 2、凝胶加样缓冲液（10×loading-buffer） 溴酚蓝 0.4% 蔗糖 60%

四、实验步骤

（一）制备琼脂糖凝胶

按照被分离的DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

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琼脂糖凝胶浓度/%

0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

线性DNA的有效分离范围/kb

5~60 1~20 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3

称取0.6g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50mL 0.5×TBE缓冲液，置微波炉或电炉上加入至完全溶化，取出摇匀，即为1.2%琼脂糖凝胶液。

（二）胶板的制备

1、将有机玻璃内槽洗干净、晾干，放置于一水平制胶器中，并放好梳子。

2、将凝胶液室温冷却至60℃左右（手触不觉烫），加入2μL EB，轻轻混匀，将混匀的胶液缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

3、待胶凝固后，将梳子轻轻拔出，将有机玻璃内槽连同凝胶一并取出放入电泳槽内，胶板点样孔端置于电场负极端。

4、加入电泳缓冲液至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面。 （三）加样

DNA样品按照10:1比例加入10×凝胶加样缓冲液（建议取6μLDNA样混合1μL加样缓冲液），混合均匀使其与DNA样品充分混合。用微量取液器将DNA样品加入加样孔中（记录点样顺序），注意细心操作，勿将胶孔戳破。

（四）电泳

1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极），DNA的迁移速率与电场强度成正比，最高电压不超过5V/cm。

2、当溴酚蓝染料移动到距离凝胶前沿约2cm处，停止电泳。 （五）观察结果

取出胶板及凝胶，将凝胶置入凝胶成像仪观察，利用波长312nm紫外光激发，观察荧光现象。EB在365nm或254nm激发光激发下显示红色荧光。

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五、实验结果

1

2

3

4

5

M

图2 PCR电泳结果图

1为PCR阳性 2~4为阴性 5为模板DNA M为marker S

将电泳图打印后贴到实验报告上，并分析实验数据。

←100bp ←250bp ←500bp ←750bp

六、思考题

1、marker的作用是什么？

2、判断图2中1的条带片段有多大？

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实验四、感受态细胞的制备

一、实验目的

学习和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法和技术

二、实验原理

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸DNA复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。

三、仪器、材料和试剂

（一）仪器

1、超净台 2、 恒温培养箱 3、低温离心机 4、恒温水浴 5、恒温摇床 6、高压灭菌锅 （二）材料

1、大肠杆菌pET28 2、氯化钙 3、琼脂 4、蛋白胨 5、酵母膏 6、吸头 7、锥形瓶 8、1.5mL离心管 9、NaCl （三）试剂

1、0.1mol/L CaCl2溶液 2、LB液体培养基

配制每L培养基，在950mL去离子水中加入： 蛋白胨 10g 酵母膏 5g NaCl 10g

调节pH到7.0，定容至1L，121℃高压灭菌20min。

四、实验步骤

1、 从平板上跳去一个单菌落于3mL LB试管中，37℃振荡培养过夜。

2、 取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h。（此时，A600应在0.4~0.6之间，细胞数<108/mL，为本实验关键）。

3、 取1mL菌液到1.5mL离心管中，冰上放置10min。

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4、 4℃，4000rpm，离心10min。

5、 倒培养液，将管口倒扣在吸水纸上以便培养液流尽。

6、 用冰冷的0.1M CaCl2 1mL悬浮细胞沉淀，立即放在冰上保温30min。 7、 4℃，4000rpm，离心10min。

8、 倒出上清液，用冰冷的0.1MCaCl2 0.1mL悬浮细胞（冰上操作），即得感受态细胞。

五、实验结果

结果须经过转化实验鉴定。

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104mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至1000ml，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内。 材料 猕猴桃若干

四 操作步骤

1、提取Vc：

称取猕猴桃10g~15g，加入15ml 2%草酸溶液，用研钵磨成匀浆。两层滤布过滤取得滤液，用少量 2% 草酸溶液洗研钵几次，倒入滤渣中，合并滤液，定容至50ml。（注意：切勿过量） 2、标准液滴定：

取Vc标准液4ml于100ml锥形瓶中，加6ml 1% 草酸溶液，用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色。记录所染料溶液的量，计算出1ml染料溶液所能氧化Vc的量。

抗坏血酸浓度*消耗抗坏血酸体积

1毫升染料氧化Vc的质量= 消耗染料体积 3、空白滴定：

取10ml 1%草酸溶液放入锥形瓶中，滴定，方法同2中的操作，作为空白对照。 4、样品滴定：

另吸取两份10ml 样品，放入两个锥形瓶中，分别滴定，方法同2中的操作 。记录染料溶液所用的体积。

五 结果、分析讨论

取两份10ml 样品所用染料溶液体积的平均值，代入下面公式计算100g样品中还原型Vc 的含量：

（V1-V2）×V×M×100

Vc含量 (mg/100g) =

V3×W

V1：为滴定样品所消耗染料溶液的平均体积 V2：为滴定空白对照所消耗染料溶液体积 V： 样品提取液的总体积

V3：滴定时所取的样品提取液的体积 M：1ml染料溶液所能氧化Vc的量（mg）

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W：样品的重量（g）

六 注意事项

1、样品提取过程避免与铜、铁接触，滴定过程要迅速，习题不超过2min，样品滴定消耗染料1~5ml为宜，如超出此范围，应增加或减少样品用量。 2、如果样品泡沫过多，可加几滴辛醇消泡。 3、样品中含有色素会干扰对终点的判断。

4、本法只能测定还原型Vc，不能测出具有相同生理功能的氧化型Vc和结合型Vc。 5、用2%草酸溶液制备提取液可有效抑制Vc氧化酶，而1%草酸溶液无此作用。

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实验九 过氧化氢酶米氏常数（Km）的测定

一、实验目的

学习米氏常数（Km）的测定方法。 了解米氏常数的意义

二、实验原理

过氧化氢酶(CAT)催化下列反应： 2H2O2→2H2O+O2↑

H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。

2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 → 2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O

求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。

1 Km × 1 + 1 =

v Vmax [S] Vmax

三、试剂

1．0.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。

2．约0.02ml KMnO4储存液 称取KMnO4 3.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，

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棕色瓶内保存。

3．0.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。

4．约0.05mol/L H2O2液 取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀释至所需浓度。

5．0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。

6. 酶液： 称取马铃薯5克，加缓冲液10ml，匀浆，过滤。

四、操作步骤

1. H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.05mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4 的ml数，求出H2O2的mol浓度。

2. 反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。

酶液

依次加入酶液每瓶0.5ml，边加边摇，反应时间5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。

最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色，记录KMnO4消耗量(ml)。

五、计算

1.反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。

反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余的H2O2 mmol数

即：H2O2 mol浓度×加入的毫升数－KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4毫升数× 5/2 （式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数） 2．求Km值：

生物化学与分子生物学实验汇编

下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。

己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.05mol/L，列表计算如下：

六、思考题

l．Km值的意义是什么？

2．测酶Km值的实验中，需要特别注意哪些操作？

生物化学与分子生物学实验汇编

分子生物学实验部分

实验一 哺乳动物基因组DNA提取

一、实验目的

学习和掌握提取基因组DNA的基本原理和实验技术方法以及大分子量DNA的琼脂糖电泳技术。

二、实验原理

在EDTA和SDS等去污剂的存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150kb，适用于λ噬菌体构建基因组文库和Southern杂交分析。

三、仪器、材料和试剂

（一）仪器

1 台式高速离心机 2恒温水浴摇床 3玻璃匀浆器 4微量取液器 （二）材料

1、猪肝 2、1.5mL离心管 3、Tris-HCl 4、SDS 5、EDTA 6、蛋白酶K 7、NaCl 8、醋酸钠 9、Tris饱和酚 10、氯仿 11、异戊醇 12 HCl （三）试剂

1、组织匀浆液（pH8.0） 10mmol/L Tris HCl 25mmol/L EDTA

100mmol/L NaCl 2、消化液（酶解液）pH 8.0

20mmol/L Tris HCl 50mmol/L EDTA 200mmol/L NaCl 200ug/L Protase K 1% SDS

3、 3mol/L NaAc（pH5.2）

4、10mg/mL Protase K：用无菌水配好后用无菌过滤器过滤，-20℃保存。 5、TE缓冲液（pH8.0）

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10mmol/L Tris HCl 25mmlol/L EDTA

6、饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1 7、氯仿：异戊醇=24:1 8、0.9% NaCl 9、无菌水

四、实验步骤

1、取0.2g猪肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在（冰浴操作，勿将细胞破碎）。

2、将组织细胞平均等分移至2个1.5mL离心管中，5000rpm离心1min（尽量低温操作），弃上清，收集沉淀。若沉淀中血细胞太多，可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗涤一次。

3、沉淀加0.4mL无菌水迅速吹散，平均等分移至2个1.5mL离心管中，每份加0.4mL消化液，翻转混匀（动作要轻），55℃水浴处理12小时。

4、取出离心管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提1次（慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大）。4℃，10000rpm离心10min。

5、用扩口吸头移出含DNA的水相（一般为上层液体，有时如果DNA含量过高，水相在下层，注意勿吸出界面中蛋白质）移入新的1.5mL离心管中，加等体积氯仿/异戊醇，4℃，10000rpm离心10min。（若发现中间界面蛋白质沉淀较多，可重复4、5操作一次）

6、用扩口吸管小心吸出含DNA水相，加1/10体积的NaAc，小心充分混匀，再向管中加入大于等于2倍体积的冰冷无水乙醇，小心充分混匀。

7、待基因组DNA脱水成丝，即为染色体丝，4℃，10000rpm离心1min，弃上清，沉淀为DNA，加入0.5mL的冰冷75%乙醇，洗涤沉淀一次，10000rpm，离心5min，尽量去除溶液，沉淀室温干燥至无明显液体悬挂在离心管壁，加入100μL TE缓冲液，溶解DNA即得哺乳动物基因组DNA溶液。

五、实验结果

生物化学与分子生物学实验汇编

图1 基因组DNA电泳结果图

左图：完整DNA电泳图 右图：弥散/降解DNA电泳图

六、思考题

1、制备高质量完整的DNA在实验操作中应该注意哪些地方，怎么操作？ 2、实验中未加RNase，对实验有何影响？

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实验二 PCR基因扩增

一、实验目的

学习和掌握PCR的基本原理和实验技术

二、实验原理

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

PCR的反应体系由如下组分组成：

DNA模板，反应缓冲液，dNTP，MgCl2，两个合成的DNA引物，耐热的TaqDNA聚合酶。

1、变性：加热使模板DNA在高温（94℃）变性，双链间的氢键断裂，形成两条单链。 2、退火：使温度降低到50-60℃，模板DNA与引物按照碱基配对原则互补结合。 3、延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热的Taq聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种dNTP，按5’→3’方向复制出互补DNA，即引物延伸。

上述三步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸三个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过30个左右循环后DNA可扩增106~109倍。

三、仪器、材料和试剂

（一）仪器

1、PCR热循环仪 2、微量取样器 （二）材料

1、DNA模板 2、dNTP 3、引物对 4、Taq酶 5、PCR管 6、吸头 （三）试剂

1、2.5mmol/L dNTP 混合物 2、Taq酶5U/μL 3、DNA模板（自制） 4、引物对

MC4R(up)： CTG AGG GAG GAT GCT ACG AG MC4R(down)： GAA GAA CAC GGT TAT GAG GC 5、10×PCR buffer 6、25mmol/L MgCl2

四、实验步骤

生物化学与分子生物学实验汇编

1、PCR体系配制

按下列添加次序，在200μLPCR管中配制50μL反应体系 10×PCR buffer 4μL 25mmol/L MgCl2 4μL 2.5mmol/L dNTP 4μL 上游引物MC4R(up) 1μL 下游引物MC4R(down) 1μL 模板DNA 1μL Taq DNA聚合酶 0.5μL ddH2O 34.5μL

2、按下列程序进行扩增 1）94℃ 预变性 10min 2）94℃ 变性 1min 3）52℃ 退火 1min 4）72℃ 延伸 1min 5）重复步骤2）→4） 30次 6）72℃ 延伸 10min 7）4℃ 保存 99min

实验结果由琼脂糖凝胶电泳检测。

五、思考题

1、PCR的原理是什么，影响因素有哪些？ 2、PCR中设计引物

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