增强化学发光酶免疫法测定血清促甲状腺激素方法的建立及初步应用

增强化学发光酶免疫法测定血清促甲状腺激素方法的建立及初步应用

梁雁 林汉华 王慕逖

【摘要】 目的 进一步提高血清促甲状腺激素（TSH）检测的敏感性。方法 通过正交试验，并经方差分析，获得增强发光酶免疫检测法的最佳实验条件，将其与TSH-酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒相结合，建立TSH的增强化学发光酶免疫检测法，并用此方法对59例健康儿童和49例甲状腺疾病患儿进行了血清TSH的检测。结果 该方法检测人血清TSH的灵敏度为0.01 mIU/L。59例健康儿童TSH的90% 正常值范围为0.74～8.53 mIU/L；17例甲状腺功能亢进患儿TSH值范围为0.02～0.40 mIU/L，无一例与正常值重叠；16例甲状腺功能正常的弥漫性甲状腺肿患儿TSH值均在正常范围上限；16例甲状腺功能低下患儿的TSH值均大于30 mIU/L。结论 该方法与RIA、ELISA比较，有良好的相关性，可基本分清甲状腺功能亢进、低下、正常三种状态，适于临床甲状腺功能的评估。

【关键词】 化学发光 免疫酶技术 促甲状腺素

Establishment and application of a new chemiluminescence enzyme

immunoassay to determine human thyrotropin in serum LIANG Yan，LIN Hanhua，WANG Muti. Department of Pediatrics, Tongji Hospital,Tongji Medical University, Wuhan 430030

【Abstract】 Objective To improve the sensitivity of

measurement of TSH in serum. Methods The authors developed a new enhanced chemiluminescence enzyme immunoassay (ECLIA), which combined luminol-H2O2-HRP system enhanced by para-iodophenol(PIP) with TSH-ELISA test kit. The optimal experimental conditions of the enhanced chemiluminescence were obtained by orthogonal design and analysis of variance. Results The sensitivity of the assay was 0.01mIU/L. The intra- and inter- coefficients of variations were 3.95% (range 1.37%～7.43%) and 6.98% (range 3.99%～10.57%), respectively. The recovery rate was 97.57%(range 93.11%～102.48%), and there was no significant cross-reaction with LH, FSH or HCG. Results of the ECLIA correlated well with those of RIA or ELISA (r＝0.94, n＝35, P＜0.001 and r＝0.98, n＝22, P<0.001). The 0.90 confidence interval of TSH for normal children by ECLIA was 0.74～8.53 mIU/L (n＝59). Circulating TSH concentrations in 17 hyperthyroids were 0.02～0.40 mIU/L, with no one in the normal range; in 16 euthyroids were all in the normal range, but concentrated on the upper limit of normal; in 16

hypothyroids the values were beyond 30 mIU/L. Conclusion The ECLIA method can discriminate hyperthyroidism, hypothyroidism and euthyroidism.

【Key words】 Chemiluminescence Immunoenzyme techniques

Thyrotropin

血清中的促甲状腺激素(thyrotropin,TSH)是反映甲状腺功能的灵敏指标。原发性甲状腺功能减退时,TSH明显升高，应用放射免疫分析法(RIA)测定即可明确诊断，但在甲状腺功能亢进时，TSH被抑制,灵敏度不够高的RIA即无法将其与正常水平区分。因此，为进一步提高TSH检测的敏感性，我们建立了TSH的增强化学发光酶免疫检测法(enhanced chemiluminescence enzyme immunoassay,ECLIA)，并对其临床意义进行了初步探讨。

材料和方法

一、材料

1.仪器和试剂：(1)LKB-1251发光光度计(LKB公司)。(2)Metrohm Herisau E350B-pH计(瑞士)。(3)鲁米诺 (Luminol,Serva) 用pH 10.3、0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液配制成5×10-2 mol/L储备液放置3天后再以pH 8.2、0.1 mol/L 碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液稀释备用。(4)30%过氧化氢(H2O2，浙江省临安县化工二厂)，使用前用去离子三蒸水配制成0.1 mol/L储备液。(5)对碘苯酚(para-iodophenol,PIP，国营上海试剂厂)重结晶提纯、用二甲基亚砜

(DMSO,Merck)配制成4×10-3 mol/L储备液，避光保存。(6)TSH-酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒(美国马克西姆生物技术有限公司)。(7)TSH-RIA试剂盒 (中国原子能科学研究院)。

2.检测对象：(1)正常组：59例，其中男31例，女28例；平均年龄为5.6±2.6岁(2～12岁)，均已排除感染及系统疾病；(2)甲状腺疾病患儿组：甲状腺疾病患儿49例，女30例，男19例；平均年龄9.3±3.3岁(1～15岁)。33例弥漫性甲状腺肿患儿均经甲状腺功能测定、血清TG-Ab和TM-Ab测定、甲状腺B超扫描检查及甲状腺细针穿刺细胞学检查；16例无弥漫性甲状腺肿大，而以弱智或生长落后就诊的患儿，均经甲状腺功能及骨龄测定。按甲状腺功能分为以下3组：(1)甲状腺功能亢进组17例(女11例，男6例)，其中Graves病10例、桥本甲状腺炎7例；(2)甲状腺功能低下组16例(女10例，男6例)，其中原发性甲状腺功能低下7例，继发性甲状腺功能低下(桥本甲状腺炎)9例；(3)甲状腺功能正常组16例(女9例，男7例)，其中单纯性甲状腺肿12例，桥本甲状腺炎4例。

检测标本均取自静脉、分离血清后迅速贮存于-25℃冰箱中待测。 二、方法

1.TSH-ECLIA的建立：将化学发光技术与TSH-ELISA试剂盒相结合，建立了TSH的增强化学发光酶免疫检测法。由于文献报道发光工作液的配制不一致［1，2］，我们采用L27(313)及L9(34)正交表进行反复试验，筛选出最佳测定条件（表1）。并经方差分析筛选出对发光强度影响较显著的因素(过氧化氢浓度、缓冲液pH值、反应温度),更好地指导了实验的条件控制。最终确定了下面的实验步骤。

表1 ECLIA最佳检测条件

项目 最佳值

Luminol浓度 5×10-4mol/L H2O2浓度 4×10-3mol/L PIP浓度 4×10-4mol/L 缓冲液pH值 8.2 温度 25℃

反应时间 10分钟

乙二胺四乙酸浓度(EDTA) 0.25 mg/ml

2.步骤：(1)配制增强发光工作液：将Luminol、H2O2、PIP储备液以pH 8.2、0.05 mol/L Tris-HCl-EDTA溶液稀释，使其终浓度分别达到最佳条件；(2)按常规的双抗体夹心法进行免疫反应：将100 μl待检血清加入TSH单克隆抗体包被好的酶联软板孔杯中，然后加入100 μl HRP标记的TSH抗体，二者充分混匀，室温孵育2小时后进行充分洗涤；(3)化学发光测定：剪下酶联软板的孔杯置于发光试管中，加入200 μl发光增强工作液，然后将发光试管放入发光仪的测试暗室中，10分钟后记录6秒的发光积分值。

RIA及ELISA检测操作均按试剂盒说明进行。 三、统计学方法

所得数据用统计学百分位数法、方差分析、回归分析及t检验进行分析处理。其中回归分析在SAS软件上进行。

结 果

一、方法学鉴定

1.灵敏度：以3个标准曲线0管的平均发光强度值加3s（2.88±0.11，n=12），本方法的灵敏度为0.01 mIU/L。

2.批内变异：5份标本用同批试剂各作3次测定，批内变异系数为1.37%～7.43%，平均为3.95%。

3.批间变异：4例标本先后5次进行测定，批间变异系数为3.99%～10.57%,平均6.98%。

4.回收实验：向4份已知 TSH浓度的血清中加入不同浓度的TSH标准品，测得回收率为93.11%～102.48%，平均为97.75%（表2）。

表2 ECLIA测定TSH的回收实验结果(mIU/L)

标本号 标本中TSH浓度 TSH标准品浓度 计算值 测定值 回收率(%) 1 10.19 2 12.19

11.35 93.11

2 10.19 5 15.19 14.81 97.50 3 10.19 10 20.19 20.69 102.48 4 10.19 25 35.19 34.20 97.19

5.特异性：标本内加入不同浓度的LH、FSH、HCG后，检测结果表明本法无交叉反应。

6.稳定性：Luminol储备液及PIP储备液4℃保存时，发光强度在3个月内无明显变化；Luminol-PIP-H2O2混和液配制好后稳定2小时并在1天内应用，测定结果无明显差异。

7.方法比较：将ECLIA、RIA、ELISA法所测值进行比较，其回归方程分别为：ECLIA测值=1.99＋0.80RIA测值(r＝0.94，n＝35，P＜0.001);ECLIA测值=-2.09＋1.43 ELISA测值(r=0.98，n=22，P＜0.001)。 二、检测结果

1.正常组：59例健康儿童血清TSH的90%正常值范围为0.74～8.53

mIU/L,P50为3.18 mIU/L。性别、年龄组之间差异无显著意义(P均＞0.05)。 2.患儿组：17例甲状腺功能亢进患儿TSH值范围为0.02～0.40 mIU/L,90%可信限上限为0.31 mIU/L，P50为0.14 mIU/L，无一例与正常值重叠；16例甲状腺功能低下患儿TSH值均大于30 mIU/L；16例甲状腺功能正常患儿TSH均在正常范围，但偏于正常值上限。其中甲状腺功能亢进组及甲状腺功能低下组TSH值与正常组比较差异有非常显著意义(P＜0.001)。

讨 论

一、ECLIA测定中方法学的问题

化学发光酶免疫分析法是用某些工具酶(如HRP)标记抗原或抗体，在免疫反应的终点再用Luminol-H2O2等发光体系测定发光强度的一种微量分析法。其基本原理是:HRP与H2O2在碱性条件下对Luminol起催化氧化作用而产生发光现象。目前国内尚无应用化学发光技术测定血清TSH的先例，国外试剂盒

(Amerlite system、LumaTag TSH等)的价格昂贵，不适于国内临床应用。我们通过正交试验并经方差分析，确立了HRP及其标记物化学发光分析的最佳实验条件,结合TSH-ELISA试剂盒，建立了TSH-ECLIA。该方法的发光动力学曲线属稳定的持续发光，发光强度衰减缓慢，因而精密度高，大大提高了TSH测定的灵敏度及检测范围。本方法的灵敏度比RIA、ELISA高20倍，批内变异、批间变异、回收率及稳定性均已达到或超过RIA、ELISA的水平，与LH、FSH、HCG无明显的交叉反应，与RIA、ELISA有良好的相关性，因此,ECLIA优于RIA及ELISA。由于它建立在化学发光和免疫分析的基础上，因此影响两者的因素均可能影响测定结果。重要的影响因素有：(1)水质：比较双蒸水和去离子三蒸水的区别，发现后者本底远低于前者，而且用三蒸水配制的试剂放置1个月以上，本底无明显升高；(2)试剂的存放时间及温度：各储备液及缓冲液均应4℃冰箱保存，H2O2试剂应新鲜配制；(3)洗涤：在操作过程中要求充分洗涤。若洗涤

不充分而残留一些酶标抗体，将会对结果产生较大的影响；(4)血清的存放与均一性：待检血清-25℃冰冻保存。为确保均一性，在检测前应将样本完全融化和混匀。尽量避免反复冻融样本。不应使用有明显溶血的标本。 二、TSH的正常含量

TSH的正常值与其抗体的特异性及检测方法有关。本方法所得TSH的正常范围与RIA(＜10 mIU/L)及时间分辨荧光免疫检测法(0.48～6.6 mIU/L) 的结果基本一致［3］。但也有一些学者得出的结论比我们的低［4，5］。造成结果差异的主要原因可能是：(1)研究对象选择不同：研究发现，部分非甲状腺疾病患者的TSH分泌受抑制，血清TSH水平小于0.1 mIU/L［6］。因此，正常组内如有非甲状腺疾病患者,会导致正常值偏小［4］。本组59例正常组儿童已排除感染性疾病及各系统疾病；(2)统计方法不同：本组资料中正常组TSH值的分布属非正态分布，这与以往的文献报道相同［3，7］。因此，在结果统计分析时，我们应用了非参数统计分析法。有些作者［4，5］以±2s的方式或检测值的分布范围表示正常值范围，似欠妥当。 三、ECLIA检测TSH的临床意义

从本组资料可以看出，用ECLIA测定基础TSH即可基本分清甲状腺功能低下、亢进及正常三种状态。辅以游离T3或游离T4的测定即可进一步区分亚临床甲状腺功能减低或亢进。同时,TSH-ECLIA的建立也为监测左旋甲状腺素替代治疗中的剂量调节带来了方便。但当TSH＜0.05mIU/L时,必须综合其他检查，以得到正确诊断［8］。在临床工作中，为正确评价甲状腺功能，还须考虑患者是否患有非甲状腺疾病或急性精神失调、是否正在接受多巴胺或糖皮质激素治疗等［9］。

总之，从方法学鉴定及临床检测结果看，我们所建立的ECLIA优于RIA、ELISA，其优点为：灵敏度高、特异性强；检测范围宽；特别是无放射性危害及半衰期短等缺陷。因此我们认为此新技术有望在TSH的测定中逐渐取代RIA、ELISA。但是ECLIA 对实验条件的要求较高，其稳定性及敏感性尚待进一步提高。

作者单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院儿科

参考文献

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