沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中表达及溶栓作用检测

【摘要】  目的 使沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中高效表达获得沙蚕激酶，并检测其溶栓活性。方法 通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切将沙蚕激酶全基因克隆进载体pGEX4T-2，诱导表达后SDS-PAGE证实该基因正常表达。构建大鼠颈动-静脉旁路血栓模型，进行目的蛋白溶栓作用检测。结果 沙蚕激酶使血栓湿质量减小，优球蛋白溶解时间（ELT）缩短（F=19.112、20.390，P<0.05），但对纤维蛋白原（FIB）影响不明显(F=1.333，P>0.05)。结论 沙蚕激酶基因表达的目的蛋白有抑制血栓形成、激活纤溶活性的作用。 
【关键词】  沙蚕激酶 基因表达 纤维蛋白溶解 大鼠
［ABSTRACT］ObjectiveTo obtain nereis kinase by effective expression of nereis kinase whole-gene in E. coli， and detect its thrombolytic activity.MethodsNereis kinase gene whole-gene was cloned into vector pGEX4T-2 by double-enzyme cut with BamHⅠ & EcoRⅠ, the gene was confirmed to be normal. A rat carotid artery-vein-bypass-thrombus model was established to determine the thrombolytic effect of the interest protein.ResultsThe wet weight of thrombus decreased and ELT shortened (F=19.112, 20.390;P<0.05), but no significant effect on FIB by nereis kinase was observed (F=1.333,P>0.05).ConclusionThe interest protein expressed by nereis kinase gene has the effects on inhibiting thrombopoiesis and activating thrombolytic activity.
    ［KEY WORDS］Nereis kinase; Gene expression; Fibrinolysis; Rats
    近年来，血栓性疾病及其纤维蛋白的溶解已成为严重的医学问题［1,2］。溶栓疗法是使已形成的血栓直接溶解的惟一疗法，即利用溶栓剂直接溶解血栓，或通过激活血液中的纤维蛋白溶酶原转化成纤维蛋白溶酶，催化血栓的主要基质纤维蛋白水解。目前, 已从不同途径研发出多种溶血栓剂、抗血栓形成剂和抗凝血剂，如链激酶(SK)、尿激酶(UK)以及其生物工程改造产品,而且已广泛应用于临床治疗中［3,4］；赤子爱胜蚓的体腔液具有强溶血活性,能够直接作用于不同哺乳动物的红细胞［5］；海藻的植物血凝素能抑制血小板的聚集［6］。研制和发展高效、特异、安全、不良反应少的溶栓药物，一直是近年来世界范围内的热门课题。本实验室发现沙蚕Nereis virens的体腔液具有纤维蛋白水解活性,推测与体内的纤溶酶有关,并进行了相关研究，成功地从沙蚕消化道上皮细胞克隆到一个具有丝氨酸蛋白酶家族活性位点高度保守序列的基因［7］。本文对其进行了原核表达和溶栓试验研究，现报告如下。
    1  材料和方法
    1.1  材料
    1.1.1  基因、酶、试剂与载体  沙蚕激酶基因为青岛大学医学院医药生物技术重点实验室专利基因；PCR试剂,限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，纤溶酶原,牛凝血酶,牛纤维蛋白原(FIB)购自Sigma公司；尿激酶为烟台绿叶制药有限公司产品；表达用载体pGEX4T-2、菌株DH5α由本室保存。肝素钠为万邦制药有限公司产品，蚓激酶肠溶胶囊为青岛国大药业有限公司产品；其他化学试剂均为分析纯。
    1.1.2  实验动物  Sprague Dawley （SD）大鼠，雌雄兼用，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，许可证号:scxk（鄂）2004-0007。
    1.2  沙蚕激酶的表达方法
    1.2.1  PCR获得全长编码序列  按照沙蚕激酶基因编码序列设计上下游引物：P1（5′-ATTGGATC-CTATATGGAGGTAACTGTGTTCTCT-3′，含B-amHⅠ酶切位点）；P2（5′-ATGAATTCTCATTGCATGACACTGTCGATGAA-3′，含EcoRⅠ酶切位点）。PCR扩增后通过BamHⅠ和EcoRⅠ酶切将该序列克隆入pGEX4T-2 Vector，转化感受态大肠杆菌DH5α，酶切鉴定后将阳性克隆送至上海生工公司测序以确保准确性。

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