年产3吨中性淀粉酶发酵工艺设计

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前言

淀粉酶属于水解酶类，是水解淀粉和糖原的酶类总称。通常通过淀粉酶

催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退

浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。此类

酶广泛存在于动、植物和微生物中，几乎所有动物、植物和微生物都含有淀粉酶。

淀粉酶是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广泛的—类酶。特别是

20世纪60年代以来由于淀粉酶在淀粉糖工业生产和食品工业中的大规模应用，

它的需要量与日俱增，到目前为止，其产量几乎占到整个酶制剂的50％以上，

销售金额占到55％～60％。按照水解淀粉的方式不向，主要的淀粉酶有α—淀粉

酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等。

淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以

高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌

中。对于高效的淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改良或者通

白质工艺改良得到。得益于现代生物技术的发展，淀粉酶在制药方面的重要性日

益凸显。当然，食品和淀粉工业仍然是主要市场，淀粉酶在这些领域的需求仍然

是最大的。

中性淀粉酶是目前使用最广泛的一种酶，主要运用于发酵、食品、医药、纺

织及造纸工业。就我国而言一般采用液态深层发酵法生产，但发酵水平低，过滤

困难，使其发展受到了较大的限制。

本课题中以枯草杆菌为实验菌株，采用液体摇瓶发酵，并在培养基中添加发

酵助剂如 Na＋和Tween—80等来提高酶活。

枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。枯草芽孢杆菌菌体自身

合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可在消化道中与动物

体内的消化酶类一同发挥作用。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有

机物中，易在枯草浸汁中繁殖。

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1. 菌种的选育

1.1 菌种的选育及制备

不管是在过去、现在和将来，微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重要，此课题设计的是利用枯草芽孢杆菌发酵生产中性淀粉酶的整体过程。

选择性分离的步骤一般是：

含微生物材料采集——标本材料的预处理——菌种的分离——富集培养——菌种初选——菌种复选——性能鉴定——菌种保藏。

1.1.1 含微生物材料的选择

土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性的土壤。 采土时先用小铲除去表土，取5～15㎝深处的土样，选好3～5点，每点取土10g混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等情况。

1.1.2 预处理

在培养过程中以淀粉作为唯一或主要碳源，控制pH在 6.7～7.2。那些在所采用的条件下最适用于淀粉代谢的微生物最终将占优势，并可在淀粉琼脂糖平板上分离到产生中性淀粉酶的菌株。

1.1.3 所需菌种的纯化和分离

可用平板划线法进行菌种分离。方法如下：用接种管蘸取少量经增殖培养后的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻划线，划线时平板面与接种环成30°～40°，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得枯草芽孢杆菌野生菌株。

1.1.4 菌株的培养

常用培养基配方：1L蒸馏水+10g蛋白胨+3g牛肉膏+15～20g琼脂+5gNaCl。本课题以麸皮、豆饼粉作为天然培养基，在37℃保温箱中培养，至培养基中部

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分出现成熟颜色即可进行保藏。

1.1.5 菌落的选择

初筛采用透明圈法，方法为在培养基里接入淀粉天青，接入含菌样品后，可在菌落周围清晰地观察到淡蓝色晕环，初筛选出的微生物经过菌株性状试验后已确定具有一定生产能力的菌株还要进行复筛。

方法：将初筛后的少数菌株接种于40 ml 锥形瓶内的液体培养基中，110次/min 往复式摇床式震荡培养，得到摇瓶种子。

1.2 诱变育种

诱变育种可以利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求如高产的个体，进而培育成新的品种或种质。

诱变育种操作程序如下：

出发菌株→纯化→培养液→细胞或孢子悬液→诱变剂处理→中间培养→平板分离→初筛→复筛→生产性能实验→菌种保藏。

1.2.1 出发菌株的选择

由于野生型菌株生产性能较差，通常采用经历过生产条件考验的菌株，即经过液体培养的摇瓶种子，这类菌株一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。

1.2.2 菌悬液的制备

细菌一般要求处于对数生长中期的菌，用玻璃珠振荡5 min，使细胞均一分散，然后用灭菌脱脂棉过滤，得到分散菌株。菌悬液的细胞浓度不宜过高，本课题中的枯草芽胞杆菌，宜将其浓度控制在108个/ml。菌悬液介质一般用生理盐水。

1.2.3 诱变剂的处理

诱变剂包括物理、化学、生物诱变，在微生物诱变育种中，可用物理化学复合诱变因素处理菌种，这样可以扩大培养幅度，提高诱变效果获得中性淀粉酶高产突变株。方法及步骤如下：

吸取制备好的枯草芽孢杆菌悬液5 ml于直径为6㎝的无菌培养皿中，然后用0.5%～1%的二乙酯处理30 min，处理时采用pH 7.0的磷酸缓冲液，再将磁力搅拌器于紫外灯下（距离30 cm）1 min，接着在红灯下吸取经处理的菌液0.5 ml，

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稀释至10-6，取10-6～10-1稀释液滴一滴于6个平板中，10-6～10-1 依次涂布均匀，再置暗箱内与37℃培养48 h。

注意：一般化学诱变剂均有毒性，多数还具有致癌作用，故操作时切忌用口吸取并勿与皮肤直接接触，做好安全工作。

1.2.4 突变菌株的筛选

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