摇床培养确定酵母菌的培养条件或营养条件

摇床培养确定酵母菌的最适营养条件和培养条件

实验方案

酵母是单细胞微生物，形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等，一般为1～5或5～20微米，它属于高等微生物的真菌类。酵母菌是兼性厌氧菌，在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水且酵母菌生长较快。在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳。酵母菌能在PH值为3.0～7.5的范围内生长，最适PH值为6~7。在低于水的冰点或者高于47℃的温度下， 酵母细胞一般不能生长，生长温度一般在20～30℃，最适生长温度范围为28～30℃。

一、实验目的

1、认识了解酵母菌的细胞形态和生理特性；

2、学习了解酵母菌的营养需求，确定酵母菌生长的最适条件； 3、掌握摇床培养酵母菌的操作技术及工艺流程；

4、掌握正交试验的概念、原理、方法及运用领域，学习设计兵进行正交试

验操作； 5、学习掌握生物量的测定方法，利用比浊法和计数法分析确定酵母菌的最

适营养条件和培养条件。

二、实验原理

酵母菌的最适营养条件和培养条件是利用PDA液体培养基摇床培养，通过正交实验设计进行的。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。正交表是一整套规则的设计表格，用L表示正交表的代号，a为试验的次数，b为水平数，c为列数，也就是可能安排最多的因素个数。本实验采用了三因素三水平的正交试验来确定酵母菌的最适营养条件和培养条件。

生物量的测定方法有比浊法、计数法和直接称重法等。由于酵母在液体摇床发酵培养过程中是以均一性的混浊液状态存在的，所以可以利用紫外分光光度计进行直接比色法来测定其生物量。

三、实验设备、材料及试剂

（一）设备

超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡培养箱、紫外分光光度计、高速冷冻离心机、电子天平、显微镜、电磁炉、锅、酒精灯、锥形瓶（250mL 10支）棉塞、烧杯（1000mL 1个，500mL、250mL、100mL各3个）以及试管若干、移液枪（5mL、1mL各一支）及枪头（无菌）若干、10mL离心管18支、血球计数板（25*16）、漏斗、pH试纸、玻璃棒、打火机、接种针、吸水纸、擦镜纸、报纸、标签纸等。 （二）材料

1、菌种：酵母菌菌种

2、培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂 （三）试剂：

蒸馏水、1mol/L的氢氧化钠溶液、1mol/L的盐酸溶液、75%酒精溶液。

四、实验方法

（一）正交试验进行酵母菌的摇床培养

在酵母菌的培养条件和营养条件中，营养条件包括碳源、氮源、矿物元素和生长因子等方面，培养条件包括摇床培养的温度、转速、时间，以及培养基的pH、装液量和接种量等，根据实验需求，本次实验选择了碳源、pH值和培养时间为因素，设计了如下的三因素三水平的正交试验进行探究，确定酵母菌的培养条件和营养条件。（每100mL培养基的配置标准）

表1 正交表试验设计

因素水平 1 2 3

葡萄糖(A) 1.0g 2.0g 3.0g

表2 正交表实验方案

编号

葡萄糖 (A)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)

1 1 1 2 2 2 3 3

pH值 (B) 1 2 3 1 2 3 1 2

培养时间 (C) 1 2 3 2 3 1 3 1

pH值(B) 6 7 8

培养时间(C) 8h 10h 12h

(9) 3 3 2

（二）比浊法和计数法测定酵母菌的生物量

酵母菌在波长为560nm的时候对光的吸收最强，利用比浊法可以间接测定酵母菌的生物量大小，进行比较。同时，也可以用血球计数板计数酵母菌悬液的菌落数。

五、实验步骤

（一）菌种的活化 1、培养基的配置

（1）菌种试管斜面（活化）培养基及母种扩大培养基

马铃薯琼脂糖培养基：马铃薯（去皮）200 g 、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml ， pH自然。试验用量为1/5。

① 称量 取去皮马铃薯40g，葡萄糖两份，每份2g，琼脂1.5-2.0g。琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量差的应适当增加。

② 将马铃薯切成小块，放入锅中，加水200mL，煮沸30 min。用双层纱布滤去马铃薯残渣，滤液加蒸馏水定容到200mL，搅拌均匀。

③ 取100mL滤液，装入250mL的锥形瓶内，加入2g葡萄糖，搅拌使糖溶解，然后加塞包扎，等待灭菌。该培养基即为酵母菌扩大培养的液体PDA培养基。 ④ 将剩余100mL马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。 ⑤ 加入2g葡萄糖，葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容到100mL。

⑥ 分装 将煮好的培养基分装于试管中，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。

⑦ 加塞 在管口塞上棉塞。棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发。

⑧ 包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称。

⑨ 灭菌 将上述培养基以0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20 min。 ⑩ 搁置斜面 将灭菌的试管培养基竖直放置，冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

（2）进行摇床培养的PDA液体培养基

① 称量 取去皮马铃薯180g，分别称取葡萄糖1g、2g、3g各三份。 ② 将马铃薯切成小块，放入锅中，加水900mL，煮沸30 min。用双层纱布滤去马铃薯残渣，滤液加蒸馏水定容到900mL，搅拌均匀。

③ 分装 将煮好的培养基分装于9个锥形瓶中，每支锥形瓶100mL培养基，编号（1）-（9），用记号笔注明。

④ 加葡萄糖，利用1mol/L的氢氧化钠溶液或1mol/L的盐酸溶液按照下表调节pH ，并向对应PDA液体培养基（每瓶100mL）中加入相应量的葡萄糖 。

序号 葡萄糖用量/g

（1） （2） （3） 1.0

1.0

1.0

（4） 2.0

（5） 2.0

（6） 2.0

（7） 3.0

（8） 3.0

（9） 3.0

pH值 6 7 8 6 7 8 6 7 8

⑤ 加塞 搅拌充分后，在瓶口塞上棉塞。棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发。

⑧ 包扎 加塞后，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。

⑨ 灭菌 将上述培养基以0.1MPa，121℃，高压蒸汽灭菌20 min，冷却待用。

2、制备斜面菌种

1、接种半小时前，打开无菌操作室和超净工作台的紫外灯，紫外照射灭菌。

关灯后，通风10min左右在进行接种操作。 2、贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期，放入超净工

作台。 3、接种 点燃酒精灯，用75%的酒精擦拭双手和超净工作台的平面。将接种

环用酒精灯外焰灼烧灭菌，冷却后用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。 4、塞棉塞 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，

不要用试管迎棉塞，以免试管在移动时带入不洁空气。 5、接种后，做好超净工作台的清洁，取出菌种后，打开紫外灭菌30min。将

斜面试管置于30℃的恒温培养箱中培养，大约一天后即可观察到斜面菌种的生长情况。待菌种长势良好后，即可进行菌种的扩大培养。

（二）、酵母菌的扩大培养

在超净工作台上，将活化的酵母菌斜面菌种从试管中接种到酵母菌扩大培养的培养基中。将接种酵母菌的锥形瓶放入摇床中进行摇床培养，摇床培养的温度为30℃，280r/min，培养24h。

（三）、酵母菌转接，摇床培养

菌种经过24h扩大培养后，在超净工作台上，用移液枪吸取酵母菌液接种于编号为（1）-（9）盛有液体培养基的锥形瓶中，每瓶接种的菌液量为10mL。提示：吸取菌液时先震荡，将菌体混匀。接种完成后，将锥形瓶置于摇床中进行摇床培养，摇床培养的温度为30℃，280r/min，培养时间如下表：

序号 葡萄糖用量/g

pH值 培养时间/h

（1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） （9） 1.0 6 8

1.0 7 10

1.0 8 12

2.0 6 10

2.0 7 12

2.0 8 8

3.0 6 12

3.0 7 8

3.0 8 10

按照培养时间取出相应的锥形瓶，至于4℃冰箱中，等待后续测定。

（四）酵母菌生物量的测定 1、离心

取18支10mL离心管，离心两组酵母菌，即每个培养条件两支，对应编号1-1，1-2，2-1，2-2，??9-1，9-2。酵母菌经过摇床培养后，摇匀，用移液枪取5mL，装入对应离心管中，配平。在8000r/min，4℃的条件下离心5分钟。弃去上清液，沉淀用5mL的蒸馏水重悬，再次离心，再用5mL蒸馏水重悬，制备成酵母菌悬液备用。

2、生物量的测定——直接计数法

该法是利用血球计数板对酵母菌悬液的酵母菌个数进行计数。取第一组酵母菌悬液进行计数操作。

（1）样品稀释 将离心后的酵母菌悬液进行梯度稀释。用移液枪吸取1mL菌悬液于试管中，加入9mL蒸馏水，摇匀后，再从中吸取1mL液体于另外一支试管中，同样加入9mL蒸馏水混匀。最终稀释倍数为100。稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜。

（2）制片 将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的盖玻片。将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,稍待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内。 （3）观察计数 选用规格为25格×16格的计数板,在显微镜下观察计数。除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数。每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数，计数原则“计上不计下，计左不计右”，最终求出总和记录数据。 3、生物量的测定——紫外分光光度法

（1）实验操作

由于酵母在液体摇床发酵培养过程中是以均一性的混浊液状态存在的，所以

可以利用紫外分光光度计进行直接比色法来测定其生物量。但是由于实验室每个组的营养条件不同，因此培养基的组成也是不相同的。在进行紫外分光光度法测定酵母菌的OD值时，可以选用离心之后的酵母菌重悬液进行测定。酵母菌的吸光波长一般为560nm。提示：但所测得的吸光值大于1时，需要对测量液体进行稀释，然后再进行测定，以保证数据的准确。

选择离心后的第二组重悬液进行OD值的测定。测定之前，将菌悬液稀释2倍，在以蒸馏水为空白组，测定不同培养条件下酵母菌的OD值。将紫外分光光度法测定的结果对应填入下面的表格（表2）中。

六、实验结果及分析

1、酵母菌计数结果分析

（1）实验数据处理：血球计数板规格为25格×16格。 （2）计算公式:

酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×10×稀释倍数。 （3）记录数据：

计数结果填入下表（表1）中，并求出各个处理条件下每毫升酵母菌的浓度（单位：个/ml），分析酵母菌的最适培养条件和营养条件。 表1 计数法测得不同培养条件下酵母菌的数量统计表（单位：个）

组别

（1）

（2）

（3）

（4）

（5）

（6）

（7）

（8）

（9）

4

数据 第一次 第二次 第三次 平均值

2、比浊法结果分析

表2 不同培养条件下酵母菌的OD值

组别

空白

（1） （2）

（3）

（4）

（5）

（6）

（7）

（8）

（9）

OD值 整理数据后，以酵母菌的吸光值为指标检测不同培养条件下酵母菌的生物量，最终分析得出不同因素的最优水平，以及最优的组合条件。最终分析得出不同因素的最适条件。

七、实验注意事项

1、酵母菌摇床培养过程中，除了碳源、pH和培养时间三个应诉外的其他培

养条件和营养条件均瑶保持在最适条件下。 2、注意高速冷冻离心机的使用安全，离心前一定要进行配平并对称放置。 3、酵母菌的活化及扩大培养尽量在无菌条件下进行，一面杂菌污染，影响

实验结果。

八、思考题

1、正交试验是设计的原理是什么？

2、正交试验的检测指标除了通过测定菌体浓度和OD值外，还有哪些方法？ 3、本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果在实验中

需要测定大肠杆菌生长的OD值，如何选择波长?

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