【摘要】 目的 建立表达人突变CD59的细胞模型，初步研究其活性。方法 以正常的CD59基因全长cDNA序列为模板，应用重叠延伸PCR法产生突变使CD59糖基化基序K41H44突变为K41K42，产生突变CD59基因，将其克隆于pALTER质粒中，构建出重组真核表达载体。应用脂质体介导法，与pcDNA3质粒共转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞, 以G418筛选阳性克隆。应用免疫化学染色及Western blot方法进一步检测突变CD59分子在转染细胞膜表面的表达。通过荧光染料释放试验，对突变CD59蛋白糖基化前后的补体限制活性进行检测。结果筛选出的阳性克隆细胞膜表面有突变CD59分子表达。将细胞的裂解物进行Western blot检测证实，在相对分子质量20 000处可见1条与CD59相当的蛋白带。表达有突变CD59分子的阳性克隆细胞染料释放率低于对照组，糖基化后染料释放率明显升高。 结论 成功地获得了表达人突变CD59分子的细胞株。
【关键词】 基因 CD59 突变 中国仓鼠卵巢细胞 补体限制作用
［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a cell model expressing human mutant CD59 molecular, and study its biological activities. MethodsNucleotides within glycosylation motif were changed to a human mutant CD59 gene (from K41H44 to K41K42) by overlap extension PCR. The mutant CD59 gene was inserted into a eukaryoticexpressing vector pALTER to form a recombinant plasmid. CHO cells were cotransfected by the recombinant plasmid and pcDNA3 via lipofectamine method. Target protein expressed on the membrane of the transfected cell lines was detected by immunocytochemistry and Western blot. Fluorescence dye was used to study the complement restriction activity of the mutant CD59 before and after glycosylation．ResultsMutant CD59 was expressed on the surface of transfected CHO cells．The dye release rate of positive clone expressing mutant CD59 molecules was lower than that of the control group. However, the rate accelerated after glycosylation. ConclusionA stable transfected cell model expressing human mutant CD59 is successfully established, which might lay the basis for further study of its biologic functions.
［KEY WORDS］genes, CD59; mutation; CHO; complement restriction activity
CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇锚于细胞膜表面的糖蛋白,相对分子质量约为20 000， 广泛分布于造血生成细胞和非造血生成细胞及多种组织细胞表面,并可以游离形式存在于尿液、唾液、泪液等多种体液中。CD59具有多种重要的免疫功能［1］，其中最主要的作用是作为补体的调节蛋白，以同源限制的方式抑制攻膜复合体(MAC)C5b9的形成，保护自身正常的组织细胞免受补体损伤。然而据报道，CD59可在糖尿病病人体内被糖基化失活，糖基化的CD59失去了 MAC限制功能 ，MAC插入内皮细胞导致了生长因子的释放，进而可引起血管增殖［2］，导致血管并发症的发生。
为了探讨人突变CD59的抗补体活性及其与糖尿病血管并发症之间的关系，我们构建了一种突变的CD59基因，并转入中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，以便进一步研究突变CD59的活性。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与细胞株 pALTER和pcDNA3以及克隆有CD59全长cDNA序列的pALTER质粒（pALTERCD59），均由美国哈佛大学提供。CHO细胞购自中科院上海细胞所。
1.1.2 主要试剂及工具酶 RPMI 1640培养液，购自HyClone公司。G418 选择抗生素，购于Amresco公司。LipofectamineTM 2000为Invitrogen公司产品。 FITC标记的CD59单抗（mAb）为Immunotech公司产品。双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧 甲酯（BCECF/AM）为SigmaAldrich公司产品。彩色蛋白质Marker由美国哈佛大学提供 。EcoR Ⅰ酶购自宝生物大连有限公司。
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