摘要：目的 利用转基因小鼠探究牙周膜内Gli 阳性(Gli1+)细胞的表达分布以及Gli1+细胞在牙周组织发育过程中的作用。方法 收集3、6和8周龄Gli1lacZ/+小鼠下颌骨,通过β-半乳糖苷酶组织化学染色(X-gal染色)观察牙周膜内Gli1+细胞的时间和空间分布特点。然后,通过注射他莫昔芬诱导3周龄Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+小鼠表达红色荧光蛋白tdTomato,对Gli1+细胞及其子代细胞(tdTomato+细胞)进行动态追踪。结果 3周龄小鼠牙周膜内分布大量Gli1+细胞,随着年龄的增长,Gli1在牙周膜内的数量逐渐减少(P<0.05)。tdTomato+细胞随着诱导时间的延长,数量逐渐增加(P<0.05),且逐渐分化成熟为成纤维细胞、牙骨质细胞和骨细胞。结论 牙周膜内Gli1+细胞具有多向分化的潜能,是牙周组织发育过程中重要的细胞来源。
关键词：Gli1 牙周组织 发育 谱系示踪 干细胞
牙周炎是发生在牙支持组织的慢性感染性疾病,是成人牙缺失的首要原因[1]。牙周炎治疗的目的是消除炎症,阻止病程进一步发展,并最终实现牙支持组织(牙周膜、牙骨质和牙槽骨)的再生[2]。探究牙周组织发育的细胞来源对实现牙周组织再生具有重大意义。
自20世纪以来,细胞谱系示踪(cell lineage tra-cing)技术已成为研究特定类型细胞在生长发育、疾病以及组织损伤修复中的作用的有效手段。目前,细胞示踪技术主要基于Cre-loxP同源重组系统。该技术通常将特定启动子驱动的Cre工具小鼠和报告基因小鼠结合使用。特异性表达的Cre重组酶可对loxP位点之间的终止序列发挥剪切作用,从而激活报告基因在特定类群细胞中表达。由于该修饰在DNA水平上进行,因此可以遗传到其子代细胞,从而实现对特定类群细胞的永久标记[3]。通过观察荧光信号可对特定细胞及其子代细胞的增殖、分化及迁移等进行动态追踪。基于此,细胞谱系示踪技术在研究体内干细胞分化命运等领域获得广泛应用[4-6]。
刺猬信号通路(hedgehog signaling)在胚胎发育、器官形成和组织修复过程中均发挥着重要的作用[7]。Gli1作为刺猬信号通路中一个重要的转录因子,已经被多项研究证实为干细胞可靠的体内标志物[8-10]。本研究旨在通过细胞谱系示踪技术实现对表达Gli1阳性(Gli1+)的细胞的动态追踪,分析其在牙周组织发育过程中的作用,以期为牙周组织再生治疗提供新的思路。
1.1 实验动物
基因型为Gli1lacZ/+、Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+的转基因小鼠(各15只)由美国得克萨斯A&M大学牙学院冯健全教授惠赠。实验小鼠饲养于恒温(22 ℃)动物房,昼夜节律为12 h/12 h。
1.2 主要仪器
冰冻切片机、激光共聚焦扫描电子显微镜(Leica公司,德国),荧光显微镜(Nikon公司,日本)。
1.3 主要试剂
他莫昔芬(tamoxifen)、多聚甲醛(paraformal-dehyde,PFA)、戊二醛(glutaraldehyde)、抗原修复液(Sigma-Aldrich公司,美国),抗原封闭液(Vector公司,美国),DMP1抗体(美国得克萨斯A&M大学牙学院冯健全教授惠赠),Periostin抗体(R&D公司,美国),Alexa Fluor 488标记的兔抗羊多克隆抗体IgG、羊抗兔多克隆抗体IgG(Life Tech-nologies公司,美国),DAPI染色液(Invitrogen公司,美国)。
1.4 β-半乳糖苷酶组织化学染色(X-gal染色)观察
取3、6和8周龄Gli1lacZ/+小鼠下颌骨,于0.5%戊二醛溶液中4 ℃过夜固定后放入10%EDTA(含2 mmol·L-1MgCl2)中脱钙,然后30%蔗糖溶液(含2 mmol·L-1 MgCl2)脱水,OCT包埋后行冰冻切片,切片厚度为10 μm。染色前将切片置于4℃ PBS中浸泡10 min以去除OCT,0.5%戊二醛固定10 min后用PBS冲洗3次,每次10 min,然后将切片置于X-gal染液中过夜。次日于显微镜下观察,可见表达β-半乳糖苷酶的细胞(即Gli1+细胞)被染成蓝色,然后用核固红(nuclear fast red)染液复染,脱水,封片,观察牙周膜内Gli1+细胞牙周组织发育过程中的表达分布。
1.5 他莫昔芬诱导Cre重组酶活性以及免疫荧光染色检测
通过对3周龄的Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+小鼠行腹腔注射他莫昔芬(75 mg·kg-1),诱导Cre重组酶进入细胞核内靶向剪切tdTomato前的转录终止序列,使得表达Gli1的细胞及其子代细胞(tdTomato+细胞)被红色荧光蛋白tdTomato所标记,从而实现对Gli1+细胞的子代细胞的动态追踪。
分别于他莫昔芬诱导后2 d(P23)、21 d(P42)、35 d(P56)采用断颈法处死Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+小鼠,取下颌骨于4%PFA 4℃过夜固定。次日将下颌骨移至10%EDTA溶液中脱钙,然后30%蔗糖溶液脱水,OCT包埋后行冰冻切片,切片厚度为10 μm。染色前将切片置于37 ℃中烤干,PBS洗去OCT后于37 ℃孵箱中行抗原修复40 min,PBS洗3次,每次3 min,滴加封闭液,室温封闭1 h后滴加相应一抗,湿盒中4 ℃过夜。次日将湿盒置于37 ℃孵箱中复温30 min,PBS洗3次,每次3 min,滴加相应荧光二抗,湿盒中室温孵育2 h,DAPI染核(呈蓝色),封片。
1.6 统计分析
通过Image J软件对牙周膜、牙骨质和牙槽骨内tdTomato+细胞以及牙周膜内β-半乳糖苷酶阳性(即Gli1+)细胞进行计数。采用spss 17.0统计软件进行单因素方差分析和Dunnett’s检验,检验水准为双侧α=0.05。
2.1 Gli1在牙周组织发育过程中的表达分布
X-gal染色结果显示,3周龄小鼠牙周膜内(尤其是根尖1/3)分布大量Gli1+细胞,随着年龄的增长,Gli1在牙周膜内的数量逐渐减少,差异具有统计学意义(P<0.05),提示牙周膜内Gli1+干细胞的数量随着牙周组织发育成熟而逐渐减少(图1)。
2.2 Gli1+细胞对牙周膜发育的作用
图 1 Gli1+细胞在牙周膜内的表达分布
Fig1The expression pattern of Gli1+ cells in periodontal ligament
左:X-gal染色,其中下图(× 200)为上图(× 80)虚线方框所对应的放大区域;右:单位面积Gli1lacZ/+细胞数,**P<0.01,***P<0.001。
他莫昔芬诱导后2 d(P23),牙周膜内仅见少量tdTomato+细胞,这些细胞呈梭形或多角形,体积较小;诱导后21 d(P42),牙周膜内tdTomato+细胞数量和所占比例增加(P<0.05),并分化成熟为长梭形的成纤维细胞,且表达Periostin(红色tdTomato信号与绿色Periostin信号重叠,呈黄色);诱导后35 d(P56),tdTomato+细胞数量和所占比例进一步增加(P<0.05),占到了牙周膜内细胞总数的33.25%(图2)。这提示Gli1+细胞是牙周膜发育过程中的重要细胞来源。
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