CM-葡聚糖凝胶固定化脂肪酶的研究

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。一 )药物生物技术第 6卷苒】期

C M.葡聚糖凝胶固定化脂肪酶的研究

陈秀墩郑毅 王绍钊 耗巧琴 吴松剐 7 _ 2 ,- -— _~ -。———一

(福建省药植所 .福州 3 5 0 0 0 1;福建师范大学生物工程学院福州 3 5 0 0 0 7 ) 摘要研究以 C M一葡聚糖凝肢为载体的固定化脂肪酶的制蔷方法幢比较固定化脂肪酶 亨辨

离酶在酶学特性上的变化。制备固定化脂肪酶的最适条件是 p H 7. O .离子浓度为 0 0 h n o【的KHz P O4 Na OH缓冲诫，加酶撞为 1 2 5 U/ g载体 .固定化反应时间为 8 h .所得的固定化酶酶墙力勾 1 2 2 5 U/ g载体，回收率为 9 8%。固定化酶的稳定性较高，最适作用 p H值为 1 0 0 .最适作用温度 '勾 4 8 ' C.其催化油脂水解操作半衰期为 3 2 5 h。因此，以C M一葡聚糖凝肢固定化脂肪酶是一种较好的固定化方法

关键词脂肪酶

; !竺：塞堡塑壁按 Na OH滴定法 J。脂肪酶的活力单位定义为 l g酶粉或 l ml酶液在一定条件下， 脂肪酶水懈橄揽油 .每分钟产生 1微摩尔脂肪酸的酶量，定为一个单位 ( u)。2 . 2蛋白质含量测定考马斯亮兰法 J,2. 3脂肪酶的固定化万法

脂肪酶能够催化酯的水解反应，从而可

以从植物油和动物脂肪中获得许多化学物质，而且脂肪酶能在有机溶剂中催化醇和酸的酯合成反应l l】,酯交换反应。氨解反

应 J,肽合成反应_ 4 j等。因此，脂肪酶在食品，轻工及药物制备等方面应用较多。目前 .脂肪酶制造油化学品的重要障碍之一是脂肪酶价格较高。而固定化酶具有可以回收，重复使用，稳定胜高，产品质量高：等优点。本文研究以 CM.葡聚糖凝胶为载体固定化脂肪

载体先用 l 0~ 2 0倍量的 0 . 5 mo l/ I盐酸浸泡，然后用蒸馏水洗至中性 .再用 1 0倍量的 0 . 5 mo l/ I Na OH浸泡，并用水洗至中性，如此反复数次，最后再用 l O倍量的

酶的最适制

备条件，固定化酶的酶学特性以及操作的稳定性。

0 . 5 mo t/ I HC 1处理成 H型，水冼至中性。砟取一定量的该载体用 p H 7 . 0, 0 . 0 1 mo 1/ !

1材

料 (2 5 0 0 U/ g脂肪酶。由

脂肪酶

KH2 P O,一 Na O H缓冲液平衡，吸出上清液，并加入一定量的酶液，搅拌均匀，在 4" C下反应 8 h,用缓冲液充分洗涤、过滤，测定滤液中蛋白质壤度，直至滤液中蛋白质浓度为零为止.真空干燥，得到固定化酶2. 4水解率的测定

P e n i c i t t i u m e . r p a n s“ 产生菌生产，福建龙马生化公司提供 );撖揽油 (上海化学试剂站分装厂 );聚乙烯醇 (聚合度 1 7 5 0 5 0,启东精细化工二厂);考马斯亮兰 G一 2 5 0 ( F l u k a进口分装 );段甲基葡聚糖凝胶 (上海长征制药厂)。

参考文献[ 5] 3结果

2方

法

2 . 1脂肪酶活力测定

3 . 1 CM一葡聚糖凝腔固定化脂肪酶的制备

收稿日期

1 9 9 8— 0 4 0 69 6 . 1 0 3 0 2 0 l

“九五”攻关课题

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陈香琳等 C M葡聚糖凝胶固定化脂肪酶的研究

2l

条件

表 3是 0 . L g脂肪酶溶于 p H 7. 0 . 0 . 0 h n o l/[表 1 KH2 P— Na OH缓冲液，不同吸附时间酶液

3 1 . 1 D H值对固定化脂肪酶的影响

是 0 . I g脂肪酶溶于 0 . 0 1 mo l/ ! K P O4一

与 I 已处理过的 C M一葡聚糖凝胶反应的结果Ta b 3 Ef f e c t。{c o u p l i n g l i me o n i mmo b i l i z e d[ i p a s eC o u p l i n g Ac t i v i t yt i me

Na OH缓冲液，在不同 p H条件下与 1 g已处理好的 CM一葡聚糖凝胶反应 2 0 h的结果Ta b 1 Ef f e c *o/p H v a]￣ e a O D i m mo b i J i e e d l i p a￣ e

P r o t e i￣

q . p e c i: E i c Re mv e r￣a c t i vi l y

Ac t i v i t yp

H

Pmt mn

sp e c i i f c Re c o v e r ya c t i v i t y

( h )4 0

( gi g…

)( m g/ g1 9 6

) ( W44 6 4 6 9 3 8 66 95 6 5 8 0 3 9 97

(%】35 t m63 I l n

( O/ g

j( n 1 B/ g

( O/ r a g p￣ j (%)

87. 50

8 0l 2 0 16 0 20 0

1 5 7 5 01 6 0 00 16 4. 5 0 L 17 5 0

2 2 72 3 9 2 50 2 94

64 00 65 8047 00

结果表明：随吸附时间的增加，固定化酶

总活力增加，但比活下降，一般吸附 8 h即可一 结果表明，在工作等电点下 p H7. 0,固定化酶总酶活、蛋白载量、比活力都是最高的，3 . 1 . 4加酶量对固定化脂肪酶的影响表

4是不同量的脂肪酶溶于 0 . 0 1 mo l/ I K P O4一Na OH缓冲液 ( p m . 0 ),酶液与 l g已处理过的 C M-葡聚糖凝胶反应 8 h的结果。Ta b 4 Ef f e c t o f t h e a mo u n t o{e n z y me I ) T I i mm o b l i i z e d] i pa s e

吸附效果最好， p H增高或降低、酶活力、比酶活和蛋白载量均下降。3. I . 2缓冲液离子浓度对固定化腊妨酶的

影响

表 2是 0 . 1 g脂肪酶溶于不同离子浓

度的 p H 7 . 0的 KH 2 P O 4一 Na OH缓冲液，与 I g已处理好的 CM一葡聚糖凝胶在 4 V下吸附 2 0 h的结果。Ta b 2 Ef fe c t o f i o n i c s t r e n g t h O D i mmo b i l i z e d[ i p a s e

En z y me Ac t M t y

Pr o t e i n

s p e c i f i c Re c o v e T yac nⅥ t y

( g ) ( u/ g

)f T T 1 g呻 ) f u, n 1 g

) (%)

I o n i cs t r e n g t h

Ac t i v i t y

P r o t e i n

s p e c i f i c R e c o v e r ya c t i v i t y

( ee

r l/ L)f u, g

)f m g, g

) ( u, m g

) (%)

结果表明：当加酶量增加一定量时，蛋白

载量，总活力及比活力都随加酶量的增加而增大；当加酶量继续增加，则比活下降，回收率下降结果表明：在低离子浓度吸附蛋白量最每 g载体加酶量 0 . 0 5 g,最适宜. 此时酶比活力最高，回收率最高。 3 . 2 C M一葡聚糖凝腔固定化脂肪酶的酶学特性

多，活力也较高，比活也较高。离子浓度在0 . 0 1 mo]/ l ~0 . 0 2 mo]￣/ I 之间.酶的固定化效果最好3 . 1 . 3吸附时间对固定化脂肪酶的影响

按 3 . 1最佳条件得出的固定化脂肪酶其酶学特陛如下所示

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