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苜蓿总皂苷提取物抗动脉粥样硬化和降血脂的实验研究(2)

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  1 材料与仪器

  1.1 受试药物苜蓿总皂苷提取物,由中山市中健药物研究所有限公司提供,批号:060828,061010。加蒸馏水配成所需浓度,4℃保存备用。

  1.2 药品和试剂绞股蓝总苷片,由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供,批号:E6A003,规格:每片含绞股蓝总苷20 mg,药片粉碎后加蒸馏水配成所需浓度,4℃保存备用;丙硫氧嘧啶片,由上海复星朝晖药业有限公司提供。批号:070901,规格:每片含丙硫氧嘧啶50 mg;维生素D3注射液,由上海通用药业股份有限公司提供,批号:080401,规格:7.5 mg/ml。总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDLC)测定试剂盒,高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)测定试剂盒,批号分别为011M042、010M050、012L028、012L028,均由上海名典生物工程有限公司提供;胆固醇,由上海科瑞生物有限公司提供;戊巴比妥钠,由北京化学试剂公司提供,批号:20071019;食用猪油,由宜昌双汇食品有限责任公司提供。

  1.3 仪器Spctrumlab 53 power紫外分光光度计,上海棱光技术有限公司产品;TB718E组织自动包埋机,湖北泰维医疗科技有限公司提供;TC120S组织自动脱水机,湖北泰维医疗科技有限公司提供;RM2135石蜡切片机,德国Leica公司产品;HM525冰冻切片机,德国Microm公司产品;802B型台式离心机,上海安亭科学仪器厂;电子精密天平,奥豪斯公司;恒温水浴锅,北京市医疗设备厂提供;WH1微型旋涡混合仪,上海泸西分析仪器厂。

  1.4 动物Wistar大鼠,SPF级,体质量(200±10)g,雄性,由湖北省实验动物研究中心提供,许可证号:SCXK(鄂)20030005。

  2 方法[1,2]

  2.1 造模取雄性大鼠50只,每只大鼠右下肢肌肉注射维生素D3 3×105U/kg,并给予高脂饲料(2%胆固醇,0.5%胆酸钠,3%猪油,0.2%丙基硫氧嘧啶,94.3%基础粉末饲料,维生素D3粉剂1.25×106 U/kg),7 d后行球囊损伤手术。另取10只作为空白对照,给予普通饲料。

  球囊损伤手术:动物用戊巴比妥钠(35 mg/kg体重)腹腔麻醉,仰卧固定,皮肤消毒,正中切开颈部皮肤,分离左侧颈总动脉,结扎远心端,插入球囊,进入约8 cm,球囊内注入0.2 ml生理盐水,向回拉动3~4 cm,放水再进入约8 cm,注水、回拉,共3次。拔出球囊,层缝合皮下组织、皮肤。消毒切口皮肤,切口处洒适量注射用青霉素粉剂。术后连续7 d给予肌肉注射青霉素,切口处用碘酒消毒。

  2.2 分组及给药术后按体质量随机分为5组。苜蓿总皂苷高剂量组:苜蓿总皂苷提取物0.7 g/kg;苜蓿总皂苷中剂量组:苜蓿总皂苷提取物0.35 g/kg;苜蓿总皂苷低剂量组:苜蓿总皂苷提取物0.18 g/kg;阳性组:绞股蓝总苷片56 mg/kg;模型组:等体积蒸馏水,灌胃同时给予高脂饲料;空白组:等体积蒸馏水,灌胃同时给予普通饲料。按体质量1.0 ml/100 g灌胃,1次/d,连续给药90 d。

  2.3 取样及检测指标末次给药后,禁食不禁水12 h,断头取血,3 000 r/min离心15 min,分离血清。用紫外分光光度计测定血清总胆固醇(TCH) (PAP法),甘油三酯(TG)(PAP法)和高密度脂蛋白(HDLC)(PTGMg2+ PAP法)的含量;并计算低密度脂蛋白(LDLC)的含量和动脉粥样硬化指数(AI)。

  分离主动脉,纵行切开,0.9%生理盐水冲洗干净,苏丹Ⅲ染色,照相,以百分率法算出斑块面积占动脉壁总面积的百分率,按分级法统计主动脉病变级别。计量资料以组间t检验进行统计比较,等级资料以秩和检验进行统计比较,百分率以卡方检验。主动脉斑块分级标准:0级内膜表面光华,无奶油色变化,即无斑块;0.5级内膜有广泛的奶油色或乳白色变化,但无凸出于表面的斑块;1级有明显的奶油色凸起斑块,面积小于3mm2;2级斑块面积大于3mm2;3级有许多大小不等的斑块,有的融合成片,大块的斑块面积超过3mm2;4级动脉内膜表面几乎为全为融合的斑块所覆盖。

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