MiniPROTEAN Cell电泳槽、Mini TransBlot电转移槽和PowerPac HC电源均为BioRad公司产品，水平电泳槽为北京六一仪器厂产品。
1.3 Agacutin亚基拆分
1.3.1 SDSPAGE分离 采用SDS聚丙烯酰胺凝胶(胶浓度∶交联度=15∶3.9)，聚合过夜，用0.01 mA恒流预电泳2 h,上样后以200 V恒压电泳45 min。
1.3.2 可逆性蛋白快速染色 用蒸馏水冲洗电泳后凝胶，将胶置于玻璃培养皿中，加染色液50 mL,震荡5 min。待胶条带显现后，用蒸馏水冲洗2～3 min，洗去多余染液。将显色后的胶置于玻璃平板上，以黑色为背景，仔细切割分离亚基胶条。将回收的亚基胶条放入脱色液(0.25 mol/L TrisHCl,0.25 mol/L EDTA,pH 8.5)脱色20 min。条带消失后，用蒸馏水冲洗胶条并进行蛋白回收或电转移。
1.3.3 蛋白回收 将含2种亚基的胶条分别放入排阻分子量为10 kDa的10 mm透析袋的一端，充满透析液，扎紧。将含胶条的一端置于水平电泳槽的阴极，在SDSPAGE电泳缓冲液中120 V恒压2 h，再反向电泳1 min。剪去含胶条一端的透析袋，用缓冲液反复冲洗另一端的透析袋，回收缓冲液，用于鉴定单亚基的纯度或实行电转移。
1.3.4 单亚基纯度鉴定 采用SDSPAGE电泳(T∶C=15∶3.9)，经考马斯亮蓝R250染色，并用脱色液脱至本底无色。
1.3.5 电转移
1.3.5.1 CAPS电转移缓冲液 取200 mL的CAPS储存液(CAPS 22.13 g，加去离子水至900 mL，用2 mol/L NaOH调pH值至11.0，定容至1 L)，加甲醇200 mL和去离子水1 600 mL。
1.3.5.2 取PVDF膜，用甲醇浸泡10 s，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。用CAPS缓冲液浸泡过物件按海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵的顺序装好夹层，放入小型电转槽中，在60 V恒压条件下，于室温下进行电转移，转移时间为1.5 h。
1.3.5.3 取出PVDF膜用去离子水略漂洗，用甲醇浸泡10 s，然后进行考马斯亮蓝染色(0.1%考马斯亮蓝R250溶于40%甲醇和1%乙酸)，染色50 s。用50%甲醇脱色后，用去离子水充分洗涤，剪下待测序的条带。
1.4 Agacutin亚基的N端氨基酸残基测序
通过反相HPLC分析和乙腈洗脱，采用Edman降解法测定亚基的N端15个氨基酸残基序列(ProciseR cLC 蛋白自动测序仪，Applied Biosystems Co.),蛋白测序仪可自动显示测序峰。
2 结 果
2.1 Agacutin纯品鉴定
Agacutin纯品经SDSPAGE电泳鉴定，在16和15 kDa处显示相近的2条带(图1)。在该电泳条件下，2 μg的上样量显示亚基得到有效分离。
2.2 单亚基鉴定
Agacutin纯品经SDSPAGE电泳分离，可逆性蛋白快速染色，分别切下含2个亚基的条带，经电泳洗脱亚基单肽链。回收的亚基在SDSPAGE电泳胶上分别显示16和15 kDa的单一条带(图2)。
2.3 亚基电转移
电洗脱回收的2个亚基，经SDSPAGE电泳浓缩为狭窄的条带，电印迹到PVDF膜，经考马斯亮蓝染色和脱色液脱色后，分别显示为单一蛋白条带(图2)。
2.4 亚基测序
2.4.1 对照样品测序结果 阳性对照见图3A，阴性对照见图3B。
2.4.2 小亚基测序结果 15 kDa亚基N端15个氨基酸残基序列为DSSGWSSYEGHEYYV,见图4。
2.4.3 大亚基测序结果 16 kDa亚基序列为DCSSGWSSYEEHQYY，见图5。
3 讨 论
自20世纪70年代起，许多蛇毒蛋白酶如Ancrod、Batroxobin、Crotalase和Reptilase (立止血)等先后被发展成临床药物。这些药物在血液止血和栓塞疾病的治疗中扮演一定的角色。由于立止血在临床上的有效性和低毒性，该类凝血酶在1996年已成为国家基本药物。尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)主要分布在我国华南、台湾和泰国、缅甸，因此该蛇毒的研究主要集中在亚洲各国。根据SDSPAGE技术和家兔血凝固时间变化，筛选了止血蛋白Agacutin。在该蛋白酶的纯化过程中，尖吻蝮蛇蛇毒中许多分子量、等电点和凝结活性相近的蛇毒蛋白长时间地影响了纯化工艺。
百度搜索“yundocx”或“云文档网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，云文档网，提供经典医药类尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序(2)在线全文阅读。
最新更新：
