摘要：目的 研究口腔黏膜癌变中小分子锌指蛋白1(LMO1)在基因转录和蛋白水平的表达变化。方法 取本课题组前期4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQO)饮水法构建鳞癌动物模型的49例样本进行苏木精-伊红(HE)染色,依据上皮异常增生程度确定实验组病理分级并确定实验分组;免疫组织化学染色定性确定LMO1的表达部位;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和Western blot检测5组样本中LMO1 mRNA和蛋白的表达。结果 HE染色确定对照组7例,轻度组6例,中度组11例,重度组9例,OSCC组16例。免疫组织化学染色检测可见,LMO1主要表达于细胞质,对照组、轻度组、中度组、重度组和OSCC组的阳性表达率分别为14.3%、33.3%、81.8%、88.9%、93.8%。RT-qPCR检测可见,对照组LMO1 mRNA的表达量最低,OSCC组最高,对照组与轻度组间mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),其余各组组间两两比较,mRNA的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测可见,随着上皮异常增生程度的加重,LMO1的蛋白表达量逐渐上升,在OSCC组中表达最高。结论 口腔黏膜癌变进程中,LMO1 mRNA和蛋白异常表达,且mRNA和蛋白表达量随上皮异常增生程度的加重而增加。
关键词：小分子锌指蛋白1 口腔鳞状细胞癌 上皮异常增生
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔颌面部常见的高侵袭性肿瘤[1],也是人类的第6大恶性肿瘤,严重威胁着患者的生命健康和生存质量。OSCC约占头颈部肿瘤的95%[2],占全身肿瘤的2%～4%以上[3];OSCC患者的5年生存率仅为50%[4-5]。小分子锌指蛋白(LIM domain only pro-teins,LMO)[6]是核转录家族的共同调节子,在胚胎发育过程中调控细胞的增殖分化、组织形成和器官发育,LMO通过介导蛋白质之间及蛋白质与各种转录因子间的相互作用,促进或抑制基因转录;LMO可通过调控细胞周期促进肿瘤形成。LMO家族有4个成员[7],LMO1、LMO2、LMO3、LMO4。LMO1主要由2个呈直线排列富含半胱氨酸的LIM结构域组成,可作为蛋白质相互作用的适配器,结合其他蛋白质形成复合体,破坏其原有结构,通过调控基因转录活性、细胞增殖分化促进肿瘤的侵袭转移[8-9]。李晓燕[10]在LMO1上调食管鳞癌的上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)的研究中发现,138例食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中LMO1的阳性表达率分别为86.9%和50.7%,LMO1在食管鳞状细胞癌中的表达明显高于癌旁组织(P<0.001)。OSCC与食管鳞状细胞癌同属于上皮源性肿瘤,LMO1是否会促进口腔黏膜癌变,目前尚无相关研究,蛋白标志物作为肿瘤早期筛查的重要指标,筛选高灵敏度的标志物对肿瘤的研究和治疗具有重要意义。因此,本实验拟对4-硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline N-oxide,4NQO)饮水法构建的SD大鼠口腔颊黏膜组织的mRNA和蛋白进行检测,以探究LMO1在OSCC发展进程中的作用。
1.1 主要材料和试剂
PageRulerprestained Protein Ladder、Veriti 96-Well聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪、高速冷冻离心机、iBright CL1000蛋白印迹智能成像系统(Thermofisher公司,美国),LMO1单克隆抗体(湖北省三鹰生物技术有限公司),磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehyd-rogenase,GAPDH)单克隆抗体(北京Abway抗体技术有限公司),LMO1引物、GAPDH引物(上海生工生物工程股份有限公司),SYBR?Greenreal-time PCR master mix(TOYOBO公司,日本),DAB试剂盒、PV9000型免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),石蜡包埋机(湖北省亚光医用电子技术有限公司)。
1.2 实验样本
本实验动物组织均源于本课题组前期4NQO饮水法鳞状细胞癌动物模型构建(已获得西南医科大学伦理委员会的同意和认可),建模方法如下。选取SPF级6周龄雄性SD大鼠84只,按照随机数字表法将SD大鼠均分装到21个饲养笼中,每3笼为一个小组,共7组。采用自动缓控系统控制灯光,设计昼夜光线明暗度循环,饲养温度为20～25 ℃,空气湿度为40%～60%,保证大鼠有充足的饲料(SPF动物专用饲料由西南医科大学实验动物中心提供)和饮水,少量多次饲养大鼠,保证食物供给充足的同时而不至于喂养过度。7组大鼠中,设置1组大鼠为对照组,6组为实验组,实验组饮用含质量分数为0.004% 4NQO的SPF级纯净无菌水;对照组饮用SPF级纯净无菌水,其余饲养条件相同。
在饲养的12、14、16、18、20、22周,随机取1组实验组大鼠乙醚麻醉后,观察记录各处病变组织的肉眼观,颈椎脱臼处死大鼠,立即将组织冻存在-80 ℃冰箱,用于后续的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative of nucleotide PCR,RT-qPCR)和Western blot实验,在实验的第12、14、16、18、20、22周,采用同样的方法,每次处死对照组大鼠2只,并获取各病变区域的颊黏膜组织,-80 ℃冰箱冻存。
本实验随机选取上述7组SD大鼠的颊黏膜组织各7例共计49例用于本实验研究。
1.3 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色
随机选取49例课题组前期建模所得组织切片按说明书进行染色,封片,然后分别由2位高年资病理科医师读片确定病理分级,参考2005年WHO分类标准,分为对照组和实验组,实验组包括轻度上皮异常增生组(轻度组)、中度上皮异常增生组(中度组)、重度上皮异常增生组(重度组)和OSCC组。
1.4 免疫组织化学染色实验
将实验用一抗兔抗鼠LMO1多克隆抗体稀释为1︰100、1︰150、1︰200、1︰300、1︰400、1︰500、1︰700共7个浓度梯度进行试验性染色,结果示1︰400稀释度下染色鉴别力最佳,因此,本实验采用1︰400的稀释度按照SP法进行LMO1染色。采用标记指数半定量分析结果:标记指数=阳性染色强度计分+阳性细胞染色率计分。阳性染色强度计分标准:在光学显微镜下,排除边缘效应和非特异性染色,其中细胞质和细胞核出现棕褐色、棕黄色、黄色记为阳性,无:0分;黄色:1分;棕黄色:2分;棕褐色:3分。阳性细胞率:高倍镜(× 400)下随机选取5个视野,利用医学图像分析软件(Image Pro-plus)计算着色细胞所占百分比,0分:阳性细胞率<10%;1分:11%～25%;2分:26%～49%;3分:≥50%。标记指数即为两者相加总分:0～1分为阴性(-),2分为弱阳性(+),3～4分为中阳性(++);5～6分为强阳性(+++);其中≥2分均为阳性表达。
1.5 RT-qPCR实验
依试剂盒说明提取各样本的总RNA,逆转录为cDNA,LMO1引物序列:F:5’-CTTTCGAGATG-GTGATGCG-3’;R:5’-ATCTCTGATTGCAGAGT-TGG-3’。GAPDH的引物序列:F:5’-ACAGCAA-CAGGGTGGTGGAC3’;R:5’-TTTGAGGGTGCA-GCGAACTT-3’。每组4个复孔,20 μL体系进行扩增,记录LMO1和GAPDH的CT值,采用??CT相对定量法进行计算分析:?CT=CT(LMO1基因)-CT(GAPDH基因);??CT=?CT实验组-?CT对照组;平均相对含量=2-平均ΔΔCT,即实验组mRNA相比对照组mRNA的变化倍数。
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