EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

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【摘要】目的构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增获取目的基因LMP2A，定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro2A，脂质体法将pMSCVpuro2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RTPCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆；收获病毒的滴度为3.2×107 CFU/L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67LMP2A。
【关键词】疱疹病毒4型人逆转录病毒潜伏膜蛋白2A PT67细胞系
［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a retroviral vector encoding EpsteinBarr virus (EBV) latent membrane protein 2A(LMP2A) and a stable virus producing cell line.MethodsThe target gene LMP2A amplified by RTPCR was subcloned into retroviral vector pMSCVpuro. The recombinant plasmid pMSCVpuro2A was transfected into packaging cell PT67 by lipofectamine 2000. The transfectants were selected by puromycin and viral titer tested. The expression of LMP2A in PT67 cell line was identified by RTPCR. ResultsThe recombinant retroviral vector pMSCVpuro2A was identified by polymerase chain reaction (PCR), restrictive analysis, and DNA sequencing. A stable virus producing cell line was selected and the viral titer was 3.2×107 CFU／L. The expected 1 500 bp fragment was amplified from PT67LMP2A cells，this result indicated that LMP2A could effectively express in packaging cell PT67. ConclusionThe recombinant retroviral vector pMSCVpuro2A was constructed successfully. A stable viral producing cell line PT67LMP2A was selected and established. This study established a foundation for further study of LMP2A.
    ［KEY WORDS］herpesvirus 4, human; retrovirus; latent membrane protein 2A; PT67 cell line
    EB病毒(EBV)属人类γ亚科疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体，与鼻咽癌(NPC)、Burkitts淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关。潜伏膜蛋白基因2A (LMP2A)是EBV潜伏期膜蛋白的一种,在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中均能检测出LMP2A，并且是NPC、BL等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一，提示LMP2A参与EBV在淋巴细胞中的长期潜伏，并且可能在恶性肿瘤的发生发展中起一定作用。由于LMP2A分子具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用，因此越来越多的研究表明，LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原。但LMP2A的生物学功能尚不清楚，为深入研究LMP2A的生物学活性，本研究通过逆转录病毒载体介导LMP2A基因的转移，旨在建立能稳定产生携带LMP2A基因的逆转录病毒的产毒细胞系PT67LMP2A。
    1 材料和方法
    1.1 主要材料和试剂
    BglⅡ、EcoRⅠ及T4 DNA 连接酶购自TaKaRa公司；脂质体转染试剂lipofectamine 2000和嘌呤霉素(puromycin)购自美国Invitrogene公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；胎牛血清购自杭州四季青公司；携带嘌呤霉素抗性基因(puro)的pMSCVpuro质粒系中国海洋大学于文功教授惠赠；工程菌Ecoli.JM109为本实验室保存菌种。

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