2.1.2 样品测定
①固体样品的测定：精密称取浓缩干燥得到番石榴叶总黄酮的固体物0.05 g,置50 mL量瓶中,加适量甲醇超声溶解,并定容至刻度,过滤,精密量取续滤液1 mL置25 mL量瓶中,按“2.1.1”项下操作,代入回归方程计算总黄酮含量。②液体样品的测定：精密量取收集所得液体样品,先定容至适当体积,滤过后,精密量取续滤液1 mL,置25 mL量瓶中,按“2.1.1”项下操作,代入回归方程计算总黄酮含量。
2.2 工艺条件的优选
2.2.1 大孔吸附树脂的预处理
以95%乙醇浸泡树脂24 h,充分溶胀后,除去上浮树脂碎片和杂物,用湿法装柱,继续用95%乙醇以适当流速通过树脂柱,洗至流出液与水(1∶5)混合不呈浑浊,再用水洗至无醇味,备用。
2.2.2 上柱溶液的制备
称取番石榴叶粗粉适量,用10倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次1 h。两次提取液合并,减压回收乙醇至无醇味,加入适量热水,抽滤,即得上柱溶液。
2.2.3 药材上样量的确定
准确称取2、4、6、8 g已处理好的FL-1大孔树脂,分别湿法装柱(12 cm×20 cm),精密吸取10 mL上柱溶液(药材浓度为0.2 g/mL,总黄酮浓度为13.22 mg/mL),以流速2 mL/min上柱,过柱液重吸附1次,经充分吸附后,收集吸附后的样品液,测定其中总黄酮的浓度,计算吸附量及吸附百分率,结果见表1。 表1 不同比例的药材与树脂测定结果（略）
由表1可知,当药材量与湿树脂量比为1∶4时,总吸附量与吸附百分率最高,因此确定药材量与湿树脂量比为1∶4。
2.2.4 洗脱液的选择
取番石榴叶250 g,用10倍量70%乙醇煎煮2次,每次1 h。合并提取液,过滤,回收乙醇,浓缩至150 mL,平均分为6份。以FL-1树脂湿法装柱(2 cm×45 cm),25 mL样品液以1 mL/min流速上柱,吸附1次,吸附90 min后,收集过柱液。用10倍量蒸馏水洗至无色,用5倍0.1% NaOH洗脱后再依次用30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇洗脱,洗脱流速为2 mL/min,收集滤液。80 ℃水浴浓缩至干,得番石榴叶总黄酮粗品。按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备并进行测定。结果由表2可知,70%乙醇洗脱收率最高。表2 各种洗脱液的洗脱结果比较(略)
2.2.5 大孔吸附树脂的再生
用4个柱体积的95%乙醇洗涤,然后再用约4个柱体积的水冲洗至无醇味,即可。当树脂使用了若干个周期时,其吸附性能有所下降,用4个柱体积95%乙醇、3个柱体积盐酸冲,水冲至中性,4个柱体积的5%氢氧化钠冲洗,再水洗至中性备用。
3 讨论
大孔树脂的吸附能力是由树脂孔径、比表面积、表面电性或形成氢键等综合性所决定。大孔树脂吸附有机物是有机物通过树脂的孔径扩散到树脂孔内被吸附,因此,孔径大小直接影响吸附效果。同时,巨大的表面积大大增加了树脂的吸附性能。另外,被吸附的化合物在溶剂中的溶解度对吸附效果也有影响,通常一种物质在某种溶剂中的溶解度大,树脂对此物质的吸附能力就小。FL-1树脂是具有一定胺基和羰基含量的中极性高比表面积吸附树脂,酚羟基与羰基、胺基之间均可以形成专一性较高的氢键作用,表面吸附的存在更加强了这种作用。正是由于这种多点协同吸附作用,能较好地提取植物叶中的总黄酮类化合物[5]。故本试验选用FL-1树脂上柱吸附。同时试验结果也表明,FL-1大孔树脂对番石榴叶总黄酮的吸附性能好。本项研究中,针对黄酮类化合物易溶于乙醇而微溶于水(溶于热水)的特点,将70%乙醇回流提取液浓缩至膏状,加热水使溶解,离心,上清液上大孔树脂柱,这样大大增加了大孔树脂的吸附能力。
一般植物提取物中的色素成分多为酸性化合物。从表2各种洗脱液的洗脱结果比较可以看出,利用稀碱溶液对大孔吸附树脂洗脱,可最大限度地洗脱色素杂质,且番石榴叶总黄酮不受影响,并能提高产品纯度。
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